GSTM5在急性肺损伤炎症反应-氧化应激环路中的调控作用机制研究

Imbalance of inflammation is always accompanied with injuries of oxidative stress in acute lung injury (ALI) and the regulation of the oxidative stress following inflammation is the key. Our previuos study showed that TNF-α activated NF-κB and increased Nox1 expression in A549. Furthermore, we found GSTM5 expressed over 2-fold and binded to Nox1 promoter. It is knowed that GSTM5 is a member of glutathione S transferase and serves as an anti-oxidative agent. We hypothesize that GSTM5 is a key point in oxidative stress pathway driven by inflammation. The gene polymorphism of GSTM5 maybe result in different levels of inflammtion and oxidative stress in ALI. To achieve the potential effect of GSTM5 in ALI, we are going to explore the effect of GSTM5 on inflammation and oxidative stress. The composite methoeds, including RNA interference, gene knockout,nucleotide mutation, IP and ChIP, are to be key steps in our study. We will check several valuable profiles such as GSTM5 expression, gene tanscription regulated by GSTM5, interaction between GSTM5 and other transcription factors. Promisingly, we can elucidate the modulation mechanism of GSTM5, which may be affected by its gene polymorphism, between inflammation and oxidative stress in ALI.

急性肺损伤（Acute Lung Injury, ALI）的炎症失衡往往伴随氧化应激损伤，对炎症反应及继发的氧化应激进行调控是减轻ALI的关键。我们的前期研究发现以TNF-α刺激肺泡上皮细胞时，NF-κB活化，Nox1表达上调，同时GSTM5表达增加，并与Nox1基因启动子结合。既往认为GSTM5仅作为转移酶催化氧化还原反应，具有抗氧化作用。而根据我们的前期研究及相关资料分析，我们推测GSTM5可能还以催化作用以外的活性参与了炎症反应/氧化应激的调控。鉴此，本课题通过RNA干扰、基因敲除、基因突变、免疫共沉淀与染色质免疫共沉淀等方法，探讨GSTM5对ALI炎症失衡继发氧化应激的调控作用，明确其基因多态性对炎症反应/氧化应激的影响，为开拓ALI治疗新靶点提供理论与实践基础。

GSTM5是体内重要的抗氧化剂，具有谷胱甘肽化各种亲电子化合物的作用。我们的前期研究发现TNF-α刺激A549细胞后，核内GSTM5与Nox1启动子结合的量上调2倍以上，提示GSTM5可能直接或者间接调控ALI（acute lung injury）时炎症反应与氧化应激平衡。因此本研究主要探讨GSTM5在急性肺损伤炎症反应-氧化应激中的非氧化酶活性的调控作用。. 本研究首先通过比较不同表达程度的GSTM5对TNF-α引起的人支气管上皮细胞（16HBE）细胞生存率差异，确定了GSTM5在16HBE的炎症反应-氧化应激中的保护性作用。其次，通过上调及下调GSTM5的表达，明确GSTM5可抑制TNF-α引起的16HBE细胞的炎症信号通路，下调炎症因子的表达水平；同时可下调Nox1的表达水平，提高总抗氧化能力，降低细胞的氧化损伤程度。我们通过共聚焦显微镜进一步证实了GTSM5在TNF-α刺激后的核转位，且在TNF-α刺激12h时入核量达到最高。我们采用双荧光素酶报告基因明确GSTM5可与Nox1的启动子结合并下调Nox1启动子的转录活性。蛋白功能分析显示GSTM5缺少经典核定位序列，可能与某种或某类蛋白共同参与对Nox1的表达调控。鉴此，我们通过用重链、轻链同位素培养不同刺激条件的细胞，标记细胞内蛋白，免疫共沉淀与GTSM5结合的蛋白，经串联质谱鉴定，结果显示H3(histone 3)等17种蛋白可能参与了GTSM5的核内作用。后续经蛋白功能分析，我们发现H3参与GSTM5调节Nox1转录的可能性比最大。H3是核小体的组成部分，其谷胱甘肽化修饰可能参与了染色质的重塑，调节下游基因的表达水平。随后，我们进一步提取TNF-α刺激后不同时相的组蛋白，发现H3的谷胱甘肽化修饰水平有很大的变化，增强GTSM5可上调核内 H3的谷胱甘肽化修饰水平，提示GTSM5可能通过调节H3的谷胱甘肽化修饰水平，介导相关基因的转录过程调节炎症反应-氧化应激环路的下游基因表达。. 综上所述，通过本研究我们明确了GTSM5可以降低急性肺损伤中的炎症信号通路的激活水平，抑制炎症反应，下调Nox1氧化酶基因转录活性，降低Nox1氧化酶基因、蛋白水平的表达，减弱细胞氧化损伤，其机制可能与GSTM5在TNF-α诱导核转位后可调节相关基因核小体的H3的谷胱甘肽化修饰有关。