利用寄主诱导的RNA沉默(HIGS)抑制镰刀菌毒素产生的机制研究

The Deoxynivalenol (DON) is mainly a toxic metabolite produced by Fusarium spp., which not only causes economic losses by affecting the productivity and quality of crops, but also endangers the food safety of human beings. Nowadays, Due to the slow progress in breeding disease resistance, the prevention of Fusarium head blight (FHB) mainly relies on chemicals, saying carbendazim. However, the long-term use of carbendazim results in the drug resistance problem. This research intends to select the key gene of the synthesis path of DON. By construct gene deletion mutants and complemented strains to filter target genes which could be used in RNA silencing. Then, screening target genes site by sRNA inhibition experiments in vitro and dsRNA silencing vector inhibition experiments in vivo. Then the RNA interference sequences from different genes were connected to form the interference fragment. Construction of RNAi vector and transform into Fusarium graminearum and Arabidopsis thaliana to verify the effect of mycotoxin control. This study can provide scientific basis for raising novel comprehensive prevention and control strategy and reducing mycotoxin contamination.

镰刀菌Fusarium spp.是引起小麦赤霉病的主要病原菌，其产生的镰刀菌毒素威胁食品安全。近年赤霉病的频繁发生和镰刀菌毒素污染超标问题日趋严重，而赤霉病抗性品种缺乏和多菌灵等化学药剂的抗药性问题致使现今对赤霉病和镰刀菌毒素控制乏力。相关研究已发现真菌存在寄主诱导的RNA沉默现象，即植物细胞的dsRNA可以在真菌侵染过程中沉默真菌基因。虽然此现象发生机理尚未完全清晰，但已经为赤霉病控制提供了新的思路。本项目拟选取镰刀菌孢子萌发和DON合成路径中的关键基因，筛选可用于RNA沉默的靶标；针对植物具有siRNA和miRNA两个不同基因沉默系统分别设计dsRNA和模拟miRNA的milRNA；利用转基因方法并通过致病力测定、RNA表达分析、抗性鉴定和毒素检测等分子和化学方法，探究dsRNA和milRNA的作用机理和效果差异，以期找到抑制镰刀菌的最佳HIGS方案，为小麦抗赤霉病品种培育提供新的资源

镰刀菌引起的小麦赤霉病和镰刀菌毒素污染问题仍然是困扰我国小麦生产和质量安全的主要影响因素。抗性品种缺乏和镰刀菌对化学药剂的抗药性导致的控制乏力使得研究RNA干扰技术等新方法控制赤霉病和镰刀菌毒素有着现实意义。本项目通过基因敲除研究了禾谷镰刀菌基因沉默sRNA剪切关键基因Dicer1、Dicer2和基因沉默复合体关键基因Ago1和Ago2的生物学功能，发现其对分生孢子的长度有显著影响，但不影响镰刀菌的致病力；通过基因敲除验证了沉默候选基因FgILV2、FgILV5、CYP51、FgCNA和FgCNB的生物学功能和对镰刀菌致病和产毒的影响，确定了FgILV2、CYP51、FgCNA、FgCNB作为RNA沉默的靶标基因；设计并构建了针对上述4个基因的具有dsRNA或者miRNA-likeRNA的沉默载体6个，转化禾谷镰刀菌，通过致病性、产毒测试等一系列表型鉴定验证了最佳的基因沉默序列；选取最优干扰序列FgILV2-3构建过表达载体转化拟南芥，验证了转基因拟南芥在镰刀菌侵染时对DON毒素积累的抑制；选择和设计基因干扰片段dsRNAILV2-1、dsRNAILV2-2、dsRNAILV2-3、dsRNACNAP1、dsRNACNAP2和dsRNACNB，使用喷施诱导的RNA沉默（SIGS）抑制了禾谷镰刀菌对小麦麦穗和大麦叶片的侵染。本研究证明了禾谷镰刀菌具有RNA沉默机制，选择对镰刀菌致病产毒的关键基因作为靶标，使用寄主诱导的RNA沉默和喷施诱导的RNA沉默技术，均可以控制赤霉病的发生。本项目研究所设计的最优干扰序列可以用于小麦转基因育种研发，也可用于核酸农药的研发。