基于分子探针与定量蛋白组学技术的抗肝炎药物双环醇的靶标鉴定研究

The project is focusing on the imperious demand of antihepatitis drug innovation research. Bicyclol, the national first-class antihepatitis drug, has tremendous clinical application values and social significance. However, the target of Bicyclol remains unknown, which limited its action of mechanism study and further application. Aiming at this key scientific problem, molecular probes and quantitative proteomics will be used for the target identification of Bicyclol. The molecular probes are rational designed based on the structure-activity relationship study, using diazirine and tetrazole as photo-cross-linkers, which have high photo-cross-linking efficiency and selectivity. The project will integrate diverse techniques including fluorescent labeling, photoaffinity labeling (PAL), click chemistry (CC), activity-based protein profiling (ABPP), two-dimensional fluorescence difference gel electrophoresis (2D-DIGE), stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC), using combined strategy of fluorescent tracing and location—photoaffinity labeling and click chemistry modification—quantitative proteomics analysis and identification—biological validation, to find the cellular target of Bicyclol, solving the problem of how to find targets of natural-products-based innovative drugs. This project will provide a solid foundation for antihepatitis and hepatoprotective action of mechanism study and new pharmacological screening model establishment. Moreover, it will provide a theoretical basis and support for rational design of new antihepatitis drugs by analyzing the drug-target interaction mode.

本项目紧扣抗肝炎创新药物研究的迫切需求，针对具有重大临床应用价值和社会意义的国家一类抗肝炎新药双环醇作用靶点未知这一核心科学问题，运用分子探针与定量蛋白组学技术开展双环醇的靶标鉴定研究。在双环醇构效关系研究的基础上进行合理的分子探针设计，选择体积最小的双吖丙啶和光交联反应效率和选择性更高的四氮唑作为光交联基团，整合荧光标记、光亲和标记、点击化学、基于活性的蛋白组分析、二维荧光差异凝胶电泳、细胞培养稳定同位素标记等技术，采用荧光示踪定位——光亲和标记与点击化学修饰——定量蛋白组学分析鉴定——生物学验证的组合策略，发现双环醇在细胞内的作用靶点，解决天然产物来源的创新药物靶标难以发现的瓶颈问题，为抗炎保肝作用机制研究和新型抗肝炎药物筛选模型的建立奠定坚实的基础。同时，分析药物-靶标的相互作用模式，为抗肝炎创新药物的合理设计提供理论依据和支持。

双环醇作为我国自主研发的抗肝炎一类新药，在肝保护领域具有重大的临床应用价值和经济社会效益，但靶点未知阻碍了其进一步的作用机制研究和打开国际市场的进程，也限制了新型抗肝炎药物的研发。本项目紧扣抗肝炎创新药物研究的迫切需求，围绕抗肝炎药物双环醇作用靶点未知这一核心科学问题，运用分子探针与定量蛋白组学技术，整合荧光成像、光亲和标记、点击化学、基于活性的蛋白质组分析等手段，采用荧光示踪定位——光亲和标记与点击化学修饰——定量蛋白组学分析鉴定——生物学验证的组合策略开展双环醇的靶标鉴定研究，解决天然产物来源的创新药物靶标难以发现的瓶颈问题。我们首先基于双环醇的构效关系合理设计合成了双吖丙啶光亲和探针、四氮唑光亲和探针、荧光探针和生物正交探针等9个双环醇分子探针，通过肝保护活性评价确定了活性最高的探针用于后续研究。开发了一系列具有高信噪比和高灵敏度的新型生物正交激活型荧光探针，通过荧光示踪定位研究揭示了双环醇在肝细胞内的靶标蛋白可能位于细胞浆内，成功缩小了靶标范围。利用光亲和探针进行了基于凝胶电泳的蛋白质组胶内荧光分析，明确了靶标蛋白分子量的大致范围，再通过基于质谱的TMT定量蛋白质组学研究结合生物信息学分析，鉴定了57个候选蛋白质。在此基础上，通过生物学验证确定了凋亡诱导因子2（Apoptosis-inducing factor 2, AIF2）、血红素氧化酶2（Heme oxygenase 2, HO2）和NADPH脱氢酶1（NAD(P)H dehydrogenase [quinone] 1, NQO1）为双环醇发挥肝保护作用的靶标蛋白。这三个蛋白质均与细胞氧化应激和凋亡过程相关，揭示了双环醇可能是作用于细胞氧化代谢通路通过多靶点机制发挥肝保护作用，为双环醇的抗炎保肝作用机制研究与新型抗肝炎药物筛选模型的建立奠定了坚实的基础。此外，我们还通过分子对接研究了双环醇与靶标蛋白的相互作用模式。计算模拟结果显示，双环醇可深入结合于AIF2、HO2和NQO1的活性口袋，并与其中的关键氨基酸形成氢键作用，为抗肝炎创新药物的合理设计提供了理论依据和支持。