AtSTK基因提高拟南芥耐盐性作用机理的研究

我们在前期工作中克隆了拟南芥丝氨酸/苏氨酸激酶基因AtSTK，经转基因检测表明，AtSTK基因的过量表达可以明显提高拟南芥的耐盐性。本研究拟通过检测该基因的表达模式、组织表达特异性和亚细胞定位，进而利用酵母单杂交技术获得调控该基因表达的反式作用因子，利用酵母双杂交筛选可能相互作用蛋白，对该基因可能的抗逆途径进行分析，初步探索该激酶参与植物抗逆作用的分子机理。.本研究对于揭示该类激酶的抗逆功能及其可能的分子作用机制具有重要意义，在理论上可以丰富对细胞激酶功能和作用模式的认识，为植物逆境信号转导提供直接的证据，同时在实践上也可以为农作物抗逆育种提供新的分子途径。

通过对拟南芥丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因AtSTK（At5g02800）进行克隆和功能研究，结果发现，AtSTK基因的过量表达可以明显提高拟南芥对盐、PEG和ABA胁迫的耐受性。生理特性检测表明，AtSTK的过量表达造成拟南芥质膜透性显著降低，脯氨酸含量明显升高，MDA含量下降，这也许是AtSTK过表达造成拟南芥抗逆性提高的生理原因。在高浓度的外源ABA条件下，AtSTK基因的过量表达明显拮抗了ABA对种子萌发的抑制作用。亚细胞定位结果表明，AtSTK普遍分布于细胞质和细胞核。组织表达特异性检测表明，AtSTK基因在拟南芥的生长点具有较强表达。信号通路的RT-PCR检测表明，AtSTK可能主要通过拟南芥的MAPK信号通路传递盐胁迫信号。.通过对AtSTK基因的启动子进行5'端系列缺失，在拟南芥中利用GUS报告基因，对系列缺失启动子的启动能力进行了检测，同时对其转基因拟南芥200mmol/L NaCl盐胁迫后的启动能力也进行了检测。最终确定AtSTK基因启动子-99bp～-180bp 和-457bp～-779bp区域有增强子作用，位于-115位点的CAAT框可能对基因表达起到了增强作用。启动子片段一旦缺失-29位点的TATA框，会造成其启动下游基因表达的能力丧失。对AtSTK基因启动子序列关键顺式作用元件的确定有助于进一步开展酵母单杂交等深入的试验检测，以探明该类基因参与植物盐胁迫应答的信号途径。.利用Clontech公司酵母单杂交试剂盒BD MatchmakerTM Library Construction ＆Screening Kits对AtSTK基因表达的转录因子进行了筛选。获得一系列阳性克隆。对阳性克隆进行初步的筛选和回复验证，菌样在上海生工进行测序，在NCBI网站进行比对发现筛选获得的拟南芥基因AT3G32090含有WRKY转录因子保守结构域，为WRKY类转录因子的一员，我们暂命名为WRKYn。对WRKYn转录因子的后续研究正在进行。.利用Clontech公司的Matchmaker® Gold Yeast Two-Hybrid System，对AtSTK进行酵母双杂交检测，已构建到pGBKT7诱饵载体，进行了自激活检测。同时对盐胁迫后的拟南芥cDNA进行了纯化、共转化酵母菌株，以期筛选获得可以与AtSTK蛋白质可以相互作用的阳性克隆。