水稻抗旱QTL区间候选基因OsRINGzf的功能和作用机制研究

干旱缺水是造成农作物减产的重要因素之一，深入研究水稻抗旱的生理和分子生物学机制，是培育节水抗旱新品种应对干旱缺水的重大科学需求。本实验室建立了基于遗传定位、生物信息学和表达谱分析的候选基因法针对抗旱QTL富集的染色体区段开展了相关研究，初步的功能研究显示其中的一个编码泛素蛋白连接酶（E3）的候选基因OsRINGzf对于水稻抗旱性具有一定作用。本研究拟采用在水稻中超量表达、抑制表达的方法来评价此候选基因的抗旱功能，并通过对此候选基因进行生物化学分析结合水稻生理、形态分析来进一步研究此候选基因的生化功能和作用机制，尝试阐明泛素蛋白质修饰在水稻发育和逆境胁迫反应中的作用。本项目的研究对深入理解植物抗旱的分子遗传机制和抗旱分子育种具有重要的理论意义和应用价值。

本研究按照研究计划对来自水稻抗旱QTL区间的一个编码E3泛素蛋白连接酶的候选基因OsRINGzf进行了功能研究，取得了预期的研究成果。定量PCR分析发现该基因明显受到干旱等逆境胁迫的诱导表达。超表达该基因能明显提高转基因水稻在PEG渗透胁迫条件下的存活率，并能显著提高在田间的抗旱性。相反，抑制表达该基因降低了转基因水稻对渗透胁迫的抵抗能力。生理指标显示超表达OsRINGzf转基因水稻中脯氨酸含量显著提高，叶片失水速率降低。亚细胞定位分析显示OsRINGzf-GFP融合蛋白主要定位于细胞膜上。对GST-OsRINGzf蛋白进行了原核表达和纯化，经体外泛素蛋白酶活性检测，发现该蛋白具有泛素蛋白连接酶活性。利用分裂泛素化酵母双杂交系统，筛选水稻叶片cDNA文库，得到了数个与OsRINGzf互作的蛋白，经GST-Pull Down进一步验证发现OsRINGzf能够与其中OsPIP2;1编码的水通道蛋白相互作用。在烟草中表达OsPIP2;1-GFP融合蛋白，免疫共沉淀后进行western blot检测，发现体内存在泛素化形式的OsPIP2;1，暗示OsPIP2;1可能是OsRINGzf泛素化修饰的底物。通过体外泛素蛋白连接反应证明OsRINGzf可以对OsPIP2;1进行泛素化修饰。进一步在烟草中共表达Myc和OsPIP2;1-GFP融合蛋白后进行western blot检测，发现OsRINGzf能够降低OsPIP2;1-GFP在蛋白水平上的表达，表明OsRINGzf通过对其底物OsPIP2;1水通道蛋白进行泛素化修饰进而促进其降解，从而正向调节了水稻对干旱胁迫的反应。本研究形成申请了1项发明专利并获得了授权。本项目的研究揭示了一种新的泛素化修饰参与水稻抗旱性反应的调节机制，丰富了人们对水稻抗旱分子机理的认识。