死亡相关蛋白激酶蛋白降解调控通路的研究

Death Associated Protein Kinase 1 (DAPK-1) is a serine/threonine kinase involved in the regulation of multiple cellular events such as apoptosis, autophagy and proliferation. Protein degradation is critical for controlling DAPK-1level and it has been found that DAPK-1 is degraded through both ubiquitin-proteasomal and lysosomal degradation pathways. In this project, we aim to search new regulatory signalling pathways controlling DAPK-1 protein degradation by using a siRNA library of E1 and E2 enzymes for ubiquitin and ubiquitin-like molecules. Once the relevant E1s or E2s are identified, we plan to investigate the mechanisms underlying their regulation of DAPK-1 degradation, which may also provide new insight into the crosstalk between proteasome and lysosome. In addition, DNA methylations of DAPK-1 gene and consequent mRNA loss have been discovered in various tumours. However, it is not clear whether DAPK-1 protein expression is also lost in these tumours. We plan to investigate the DAPK-1 protein levels in primary tumour samples that are known to be low or null in DAPK-1 mRNA expression. If DAPK-1 protein is detected in these samples, we will investigate the mechanisms for the imbalance of mRNA and protein, which will start from the degradation pathways. Our results will provide a broader understanding of DAPK-1 degradation, shed light on the interaction between two degradation pathways and verify the idea of using DAPK-1 gene methylation as a tumour marker.

死亡相关蛋白激酶 (DAPK-1) 是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，在细胞凋亡、自噬、增殖等生理过程中具有重要作用。DAPK-1蛋白同时受到了蛋白酶体与溶酶体降解通路的双重调控，但目前对其调控机制的研究仅限于蛋白酶体通路中的E3上。本项目将利用泛素或类泛素小分子E1和E2的siRNA库，探寻影响DAPK-1蛋白降解的新信号通路及其作用机制，同时也将研究蛋白酶体与溶酶体两条蛋白降解通路之间的互动（crosstalk）。此外DAPK-1基因的甲基化及随之而来的mRNA表达缺失在许多癌症中都有报导，但对与之相关的蛋白表达却所知甚少。我们将在慢性淋巴白血病的原发性癌症样本中考查DAPK-1的蛋白表达，并与其mRNA表达进行对比，探讨蛋白降解通路在癌症中对抗癌基因表达调控的重要性。我们的研究将有助于更全面地理解DAPK-1蛋白的降解，完善其分子调控网络，并为DAPK-1在癌症中的表达调控提供更深入的理解。

死亡相关蛋白激酶 (Death Associated Protein Kinase 1，DAPK-1) 是一种在细胞凋亡 、自噬 、增殖等过程中具有重要作用的丝氨酸-苏氨酸激酶。DAPK蛋白降解同时受到泛素-蛋白酶体途径和溶酶体途径的双重调控。申请者前期研究表明UBE2I (又名UBC9，为类泛素小分子蛋白sumo-1 (Small Ubiquitin Like Molecule 1) E2)可以调节TSC2介导的DAPK降解。当SUMO信号通路被激活时，DAPK蛋白的表达下调；当SUMO信号通路被抑制时，DAPK蛋白的表达上调，而TSC2蛋白(Tuberous Sclerosis)引导的DAPK蛋白降解受到了抑制。本项目在前期基础上利用了点突变技术构建DAPK的缺失突变体。发现SUMO特异性蛋白酶（SENPs）引导DAPK蛋白的稳定性，是通过DAPK蛋白的1-364区实现的。通过软件预测DAPK的SUMO化位点，构建点突变体，发现SUMO信号通路调控DAPK蛋白的表达是依赖于DAPK第141位和167位的赖氨酸残基。实验发现蛋白酶体抑制剂MG132 或共转SENP6均能明显提高DAPK蛋白的表达。同时半衰期实验结果显示MG132能延长DAPK蛋白的半衰期，但是DAPK两个点突变位点载体DAPK (K141A and K167A) 对其半衰期并无影响。因此SUMO信号通路调控DAPK蛋白的表达可能是通过溶酶体途径降解来实现的。此外，蛋白的表达除受到降解和翻译的调控，还受到mRNA的调控。DAPK基因甲基化与多种癌症的临床病理特征相关，本项目通过检测乳腺癌患者组织的DAPK基因甲基化水平、蛋白表达量、mRNA表达量，发现DAPK基因甲基化与DAPK蛋白表达量和mRNA表达量之间并没有相关性。检测DAPK在肝癌细胞中的表达，结果显示DAPK与肝癌患者血清检测到的AFP(甲胎蛋白)具有显著相关性，同时DAPK和肝癌患者的生存率也密切相关。.DAPK作为一个潜在的药物靶点正受到越来越多的重视。本研究发现SUMO信号通路可以调控DAPK蛋白的表达且其调控可能是通过溶酶体途径降解实现的。且在乳腺癌组织中DAPK基因甲基化与DAPK蛋白表达量和mRNA表达量之间并没有相关性。这有助于我们更加全面深入地了解DAPK蛋白的降解调控，有助于开发与DAPK蛋白相关的新药。