家蚕微孢子虫锰超氧化物歧化酶结构、定位、遗传分化及功能作用

Manganese superoxide dismutase (MnSOD) is a ubiquitous metalloenzyme that catalyze the dismutation of toxic superoxide anions to molecular oxygen and hydrogen peroxide. Studies have shown that most organisms contain only a single MnSOD gene, however, two MnSOD genes were found to be organized in a tandem array within the reduced and compacted genome of Nosema bombycis. Thus, in this project, we will confirm the antioxidant role of MnSOD when N. bombycis infect and proliferate in Bombys mori by the enzyme activity and transcriptional profiling, comparing Escherichia coli K12 and E. coli K12-△MnSOD. Meanwhile, we will show the specificity of two N. bombycis MnSODs through differential transcriptional profiling, identify their subcellular localization using colloidal-gold labeling in electron microscopy, and analyze their protein structure by bioinformatics. Combined with their genetic analysis, we will discuss the divergence of the two MnSOD genes, and explain why the duplication of manganese superoxide dismutase took place in Nosema bombycis. Whether they may function in different tissues or times of its host or simply resulting in an increase in expression.

锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是一类广泛存在的抗氧化物酶，在清除氧化应激、维持生命体稳定上具有重要作用。绝大多数已报道基因组物种都以单基因MnSOD开展抗氧化效应，但在基因组减缩紧密的家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)中，MnSOD基因却发生了串联重复事件，这可能具有某种意义存在。 本项目拟基于前期分析，利用大肠杆菌及其MnSOD缺陷菌株注射家蚕作为对照，分析在感染家蚕不同时期时家蚕微孢子虫MnSOD酶活性及转录谱，明确MnSOD在侵染家蚕及增殖过程中的转录表达，探讨其抗氧化功能发挥的作用。进而利用转录谱分析家蚕微孢子虫串联重复两个MnSOD基因的时期表达差异，通过免疫胶体金电镜鉴定两个MnSOD在家蚕微孢子虫中的亚细胞定位（细胞质胞浆或线粒体），运用生物信息分析软件预测两个MnSOD蛋白质结构（二聚体或四聚体），并结合自然选择压力和系统进化的信息学分析，研究其基因分化现象。

锰超氧化物歧化酶(MnSOD)是一类广泛存在的抗氧化物酶，在清除氧化应激、维持生命体稳定上具有作用。绝大多数已报道基因组物种都以单基因MnSOD开展抗氧化效应，但在基因组减缩紧密的家蚕微孢子虫(Nosema bombycis，Nb)中，其NbMnSOD基因却发生了串联重复事件，这可能具有某种意义存在。. 为此，本项目通过分析感染家蚕不同时期NbMnSOD的酶活性及转录谱，以及大肠杆菌MnSOD缺陷菌株不能感染家蚕证实了MnSOD在家蚕微孢子虫感染家蚕及增殖过程中具有重要作用。本项目还通过分析串联重复NbMnSOD1与NbMnSOD2的表达特异性，证实了两个基因存在着功能互补而非功能叠加的作用。通过胶体金标记免疫电镜鉴定了NbMnSOD1定位于胞浆，而NbMnSOD2定位于极管和孢壁，并通过间接免疫荧光进行了肯定，发现了二者在亚细胞定位上的差异。通过蛋白质结构分析，发现NbMnSOD1为二聚体结构，而NbMnSOD2为具有部分四聚体特征的二聚体结构，表明二者在蛋白质结构上的差异。通过自然选择压力分析，认为NbMnSOD2是NbMnSOD1基因重复产生的，而其中的突变是正向选择压力的结果。因此，两基因在转录表达、亚细胞定位、蛋白质结构、自然选择压力上的差异，表明它们发生了基因分化，并推测NbMnSOD1主要作用于微孢子虫在宿主中的增殖，而NbMnSOD2主要作用于侵染宿主。. 本项目通过构建系统进化树，发现NbMnSOD是来源于细菌的水平转移基因，并将水平基因转移研究扩展到整个微孢子虫门，鉴定到微孢子虫372个水平转移基因，也同时佐证了微孢子虫与真菌的亲缘关系。通过密码子偏好性分析微孢子虫基因组进化，认为NbMnSOD基因之所以能在基因组紧密压缩的微孢子虫中发生水平转移、基因重复、基因分化等基因扩张现象，是由于家蚕微孢子虫基因组受到较弱定向突变压力的结果。此外，还对MnSOD蛋白质结构分析进行延展，发现了MnSOD基因的趋同进化现象。. 本项目的完成不仅解答了NbMnSOD的基因起源、基因重复、基因分化及其内在动力的科学问题，还为利用NbMnSOD尤其是NbMnSOD2基因作为靶标，通过氧化剂防治家蚕微粒子病乃至人畜微孢子虫病奠定了科学基础。