跨损伤合成蛋白复合物Rev1-Rev3-Rev7的晶体结构和功能研究

Cellular DNA damage occurs by constant exposure to exogenous genotoxic agents or endogenous cellular metabolites, which leads to instability of the genome and even induces cancer generation if not repaired. To maintain the genome integrality, such lesions must be eliminated by DNA repaire mechanisms, including base excision repair, nucleotide excision repair， mismatch repair， homologous recombination, translesion synthesis and so on. Among these DNA repair mechanisms, translesion synthesis is one of the DNA damage tolerant mechanisms, in which cells use a set of specialized, nonreplicative DNA polymerases to synthesize across the damaged template. However, the switching mechnism of the TLS polymerases remains unclear. Rev1 and polζ are two important TLS polymerases in translesion synthesis progress. polζ consists of two subunits, Rev3 and Rev7, which can form complex with Rev1 to function in cells. We plan to carry out the structural and biochemical studies of the complex of Rev1, Rev3 and Rev7, to illustrate the 3D structure of Rev1-3-7 complex and the switching mechnism of the TLS polymerases, and provide a starting point for further investigations and development of new anticancer agents.

基因组DNA的损伤需要一系列机制来进行修复，否则将导致基因组的不稳定，并可能进一步引发癌症。生命体发展了一系列复杂的修复途径来对抗这些损伤，包括切除修复、错配修复、重组修复、跨损伤合成修复等等，以保证基因组的完整性。其中跨损伤合成修复（translesion DNA synthesis, TLS）是一种DNA损伤耐受机制,它需要多种特殊的TLS聚合酶参与和转换来直接复制和通过受损模板上的缺口部位，但是目前聚合酶转换的调控机制尚不清楚。Rev1 和polζ 是跨损伤合成过程中两种重要的TLS聚合酶，polζ 由Rev3和Rev7 两种亚基组成，Rev1可以与Rev3和Rev7形成复合物发挥作用。本项目旨在通过对这三个蛋白的复合物开展结构和功能研究，阐述Rev1-3-7复合物在跨损伤合成修复中的功能机制，深入分析跨损伤合成过程中TLS聚合酶转换的分子机制，并为肿瘤药物的研究和开发提供依据。

基因组DNA的损伤需要一系列机制来进行修复，否则将导致基因组的不稳定，并可能进一步引发癌症。生命体发展了一系列复杂的修复途径来对抗这些损伤，其中跨损伤合成修复（translesion DNA synthesis, TLS）是一种DNA损伤耐受机制,它需要多种特殊的TLS聚合酶参与和转换来直接复制和通过受损模板上的缺口部位。人体有五种跨损伤合成聚合酶，包括4种Y家族DNA聚合酶（Polη，Polι，Polκ和Rev1）和一种B家族聚合酶Polζ（包括Rev7和Rev3两个亚基）。. 跨损伤合成的过程就是不同类型的DNA聚合酶，在支架分子的介导下，依次转换并行使催化功能的过程。为了回答不同的聚合酶之间是如何协调并得到有序的转换这一个跨损伤合成的基本问题，我们分别解析了2.7 Å的Rev1-3-7复合物晶体结构和3.2 Å的Rev1-3-7-Polκ复合物晶体结构。复合物的晶体结构显示，位于Rev1的C端跨损伤合成聚合酶相互作用区的主体为4个α螺旋组成的筒状结构，在筒状结构之前是N端的β发卡结构，之后是C端的tail。Rev7和Polκ可以同时结合在Rev1的不同区域。Rev7结合于Rev1的C-tail与α2-α3 loop，Polκ结合于Rev1的N端β发卡结构，α1和α2螺旋以及α1-α2 loop形成的疏水口袋中。. 我们利用GST pull-down实验验证了Rev1与Rev7表面的关键氨基酸位点对它们之间相互作用的影响。同时通过BIAcore实验，我们证明Rev3与Rev7的结合可以增强Rev7与Rev1的相互作用。此外，FRET实验证明了Rev3、Rev7、Rev1和Polκ在体内也可以形成稳定的四元复合物。基于结构和功能的分析，我们提出了新的跨损伤合成聚合酶转换的模型，即在跨损伤的第二步，Rev1行使支架蛋白的功能，介导inserter聚合酶转换成extender聚合酶的过程中，因为inserter聚合酶（如Polκ）和extender聚合酶（Polζ）可以同时与Rev1结合，所以此过程不需要inserter聚合酶的解离。. 已有大量研究发现跨损伤合成是癌症的发生和癌细胞的产生抗药性的重要原因，跨损伤合成聚合酶与很多疾病比如着色性干皮症和痢疾等也有密切关系，因此，跨损伤合成相关蛋白复合物结构的解析也为相关药物的设计提供了新的基础。