CLDN18-ARHGAP26融合基因通过JNK3/MAPK信号通路介导胃癌化疗耐药的分子机制研究

Chemotherapy resistance is one of the most important factors which can significantly influence the prognosis of gastric cancer patients. Our previous research identified that CLDN18-ARHGAP26 fusion is significantly corelated with chemotherapy resistance of gastric cancer patients by whole genome sequencing and clinical validation. Further, vivo and vitro experiments also demonstrated that the fusion gene was related to chemo-resistance in cell lines. RNA sequencing found JNK3 gene is the significantly up-regulated downstream gene of CLDN18-ARHGAP26 gene. JNK3 plays a vital function in chemotherapy sensitivity regulatory via JNK3/MAPK pathway, and ARHGAP26 can regulate the JNK3 phosphorylation to active the JNK/MAPK pathway through active Rho GTPase. Therefore, we present the hypothesis that CLDN18-ARHGAP26 fusion gene may regulate the Rho GTPase and active JNK3/MAPK pathway to induce chemotherapy resistance. This study will adopt PCR, Western Blot, Pulldown, CRISPR/CAS9 and xenograft tumor model to illustrate the molecular mechanism of CLDN18-ARHGAP26 /JNK3/MAPK pathway in regulating the chemo-sensitivity of gastric cancer.

化疗药物耐药是影响胃癌预后的重要因素之一，多种因素参与调控胃癌化疗敏感性。我们前期通过全基因组测序并通过临床病例验证分析发现CLDN18-ARHGAP26融合基因与胃癌化疗耐药相关，在细胞系和体内动物实验中均证实该融合基因可引起胃癌化疗耐药，转录组测序分析发现该融合基因导致JNK3基因上调。JNK/MAPK信号通路在调控肿瘤化疗敏感性中起重要作用，Rho GTP酶作为ARHGAP26调控底物参与JNK3活性调节。据此，我们提出CLDN18-ARHGAP26融合基因通过Rho GTP酶调控 JNK/MAPK信号通路介导化疗药物耐药的科学假说。本课题拟通过定量PCR、Western Blot、Pulldown、CRISPR/CAS9及移植瘤模型等技术，阐明CLDN18-ARHGAP26 /JNK3/MAPK信号通路介导胃癌化疗耐药的分子机制，为胃癌化疗治疗药物靶点筛选提供实验依据。

胃癌是我国疾病负担较大的恶性肿瘤之一，初诊肿瘤分期较晚、肿瘤异质性较大、化疗药物耐药是影响胃癌预后的重要因素，多种因素参与调控胃癌化疗敏感性。其中胃印戒细胞癌是胃癌中特殊病理类型之一，我们研究发现发现CLDN18-ARHGAP26融合基因与胃癌化疗耐药显著相关，但对其调控胃癌化疗耐药的机制还不清楚。本课题旨在研究CLDN18-ARHGAP26融合基因调控胃癌化疗耐药的分子机制。首先，我们通过GST Pulldown实验发现CLDN18-ARHGAP26融合基因并未对ARHGAP26基因下游关键分子RhoA、Cdc42、Rac1的活性造成影响。进而，我们通过结合CLDN18-ARHGAP26融合基因稳转胃癌细胞系以及胃癌组织样本转录组测序进行综合分析和预测，发现CLDN18-ARHGAP26融合基因参与调控关键分子IFIT2、LAMA4与NRP1及关键信号通路PI3-Akt信号通路，并在蛋白水平进行了验证。我们还通过筛选已有小分子药物库，发现PI3K-AKT信号通路抑制剂Usnic acid对CLDN18-ARHGAP26融合基因表达的胃癌细胞敏感，该结果从实验层面证实了生物信息分析预测。同时，我们还通过Cre-Loxp系统构建了CLDN18-ARHGAP26融合基因条件表达的小鼠原发胃癌模型，该模型有望为后续CLDN18-ARHGAP26融合基因在胃癌发生、发生、发展以及转移中的机制研究提供重要支撑。此外，在本项目中，我们利用胃癌组织样本转录组测序数据，通过生物信息学分析筛选出与进展期胃癌异质性临床结局相关的特征基因集及RNA分子分型，并在组织以及细胞水平证实该基因集主要参与肿瘤微环境调控以及上皮间质转化调控。同时，我们还筛选出一个胃癌特征lncRNA，HOXC-AS2，其与进展期胃癌特征基因集及患者不良预后显著相关。我们还通过体外细胞实验及体外小鼠模型，证实HOXC-AS可以通过YBX1调控胃癌肿瘤细胞侵袭、迁移。本研究结果及发现为进一步解释胃癌临床异质性及生物学行为的关系提供了实验依据。