基于高通量转录组测序的巴西橡胶树雄性不育分子机制的研究

Rubber tree (Hevea brasiliensis) is one of the most important sources of natural rubber; it's an important crop for tropical and subtropical areas in China. The male sterile germplasm of rubber tree has played an important role in crossbreeding, however, the molecular mechanisms of male sterility have rarely been reported in rubber tree. In this study, after observing the cytological and morphological characteristics of male flower at different developmental stages, we will use high-throughput RNA sequencing(RNA-seq) to screen the differentially expressed genes between male-sterile and normal flowers at the same stage, perform GO annotation and KEGG pathway enrichment analysis to screen the candidate genes related to male sterility from the differentially expressed genes, employ qRT-PCR and mRNA-FISH to detect the temporal and spatial expression of these genes, use the Agrobacterium-mediated genetic transformation in Arabidopsis thaliana to validate the function of some key genes. The research results will reveal the molecular mechanisms of male sterility of rubber trees, including finding the male sterility-related genes, investigating the function of these genes, and clarifying the relationship between the temporal and spatial specificity of gene expression and cytological abnormalities at different developmental stages. It would provide a scientific basis for crossbreeding and heterosis utilization of rubber tree.

巴西橡胶树是一种重要的产胶植物，也是我国热带、亚热带地区重要的经济作物。橡胶树雄性不育种质是橡胶树杂交育种亲本选配的重要资源。然而，橡胶树雄性不育相关机制方面的研究报道尚少。本项目拟在对橡胶树雄花发育动态的细胞学和形态学特征观察的基础上，利用高通量转录组测序技术（RNA-seq），通过对橡胶树正常雄花与不育雄花之间在同一发育阶段的转录组比较分析，筛选出各发育阶段的差异表达基因；对这些差异表达基因进行GO注释和KEGG通路富集分析，推测出雄性不育相关的候选基因；进一步利用qRT-PCR和mRNA-FISH技术对这些候选基因的时空表达特征进行分析，进而进行克隆与转化拟南芥验证。由此明确橡胶树雄性不育所涉及的相关基因及其作用与功能，明晰这些相关基因在雄花发育不同时期的时空表达特征与异常细胞学特征的关系，从而从分子水平揭示出橡胶树雄性不育的机制，为橡胶树杂交育种和杂种优势利用提供科学依据。

巴西橡胶树是一种重要的产胶植物。雄性不育种质是橡胶树杂交育种亲本选配的重要资源。然而，橡胶树雄性不育相关机制方面的研究报道尚少。本项目的主要研究内容是：观察橡胶树雄花败育的形态学和细胞学特征；在此基础上，通过高通量转录组分析（RNA-seq），差异表达基因的定量（qRT-PCR）与原位表达（mRNA-FISH）分析，以及拟南芥遗传转化验证，挖掘出橡胶树雄性不育的重要相关基因，由此揭示橡胶树雄性不育的分子机制。主要研究结果为：（1）雄花小孢子异常发生在小孢子四分体后期至单核期阶段，主要败育特征包括小孢子相互黏连而无法完全游离，绒毡层细胞、小孢子原生质和小孢子壁都呈现异常。（2）通过RNA-seq分析，筛选出了与雄性不育相关的差异表达基因1590个（表达上调970个，下调620个）；对这些差异表达基因进行了GO功能注释和KEGG信号通路富集分析，筛选出了111候选基因。（3）筛选出了差异表达的线粒体基因3个（orf126、orf51和atp8），其中orf126和orf51为雄性不育品种线粒体基因组的特异插入片段，可作为分子标记。（4）对候选基因在橡胶树不同器官的表达模式进行了qRT-PCR分析，从中挖掘出了25个雄性不育相关的重要基因，这些基因在雄花中的表达水平显著高于叶片、皮、胶乳和雌花；对雄花发育的3个阶段（小孢子母细胞期、四分体期和单核小孢子期）的表达变化趋势分析显示，这些重要基因大多在小孢子四分体期和单核小孢子期发挥作用。（5）对19个重要基因在小孢子四分体期雄花表达的mRNA-FISH检测表明，这些基因的表达主要集中在雄蕊中，多数基因在花药表皮细胞和四分体孢子中有明显的表达，其中GEX1和LURP12基因还在绒毡层有明显的表达。（6）克隆了13个基因全长并构建了超表达载体；另外还构建了6个基因的基因敲除载体；转LURP12等基因的拟南芥植株表现为雄蕊败育现象。本研究明确了橡胶树雄性不育所涉及的相关基因及其作用与功能，明晰了这些相关基因在雄花的时空表达特征与细胞学特征出现异常的关系，从细胞学和分子水平揭示了橡胶树雄性不育的机制。本研究成果将可为橡胶树杂交育种和杂种优势利用提供重要的科学依据。