基于高通量定向转录组测序技术（ssRNA-seq）的水稻基因选择性剪切研究

Alternative splicing (AS) is widespread in higher eukaryotes. AS produces multiple mRNA transcripts from a single gene through the selection of alternative splice sites in the pre-mRNA. Hence, AS increases the protein complexity of an organism. Changes in protein structure and function, mRNA stability and regulation of gene expression are the main consequences of AS. Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important crops and an excellent monocotyledonous model plant. Here, we will apply high-throughput strand-specific complementary DNA sequencing technology (ssRNA-seq) to deeply sequence mRNA for globally assembling transcriptome and subsequently obtaining a true map of AS in rice. Our study will focus on the identification of novel transcripts, novel AS genes, and differentially expressed AS patterns in 7 to 10 tissues derived from various developmental stages and different stressed conditions. In addition, we will try to provide a comprehensive platform of our data for researchers. In summary, based on advantages of high-throughput sequencing technology and experiences in massive data analysis, we are able to survey rice global alternative splicing patterns in an efficient, low-effective and accurate way.

高等真核生物中，基因选择性剪切是广泛存在的增加蛋白多样性的有效方式，也是调控蛋白表达的重要机制。水稻是世界上最主要的粮食作物之一，也是重要的单子叶模式植物。在水稻全基因组范围内鉴定选择性剪切模式，对系统研究水稻基因的功能具有重要意义。本研究将充分利用新一代高通量定向转录组测序技术的特点，对粳稻日本晴7-10个不同生长时期和胁迫条件下组织的微量mRNA进行高通量测序，通过序列组装获得尽可能完整的水稻表达序列信息，从而在全基因组范围内绘制水稻选择性剪切图谱，包括准确鉴定、定位和完善基因选择性剪切事件，并比较分析在特定生长时期和胁迫处理下的表达模式的异同。与以往的研究不同，本研究的优势在于将充分利用高通量测序技术和本实验室在水稻表达谱等高通量测序数据分析的经验, 全面分析并完善原有鉴定方法不易检测到的可变性剪切模式，为开展水稻功能基因组研究建立完善数据库。

本项目利用定向的转录组高通量测序技术（ssRNA-seq）系统开展了水稻选择性剪接模式的鉴定与分析。在这一研究中，除了完成了水稻不同组织、不同胁迫条件下的转录组测序分析和数据库构建之外，突出的研究成果是首次发现水稻转录组中有大量的环状RNA（circular RNA，circRNA）。通过深度测序和计算分析定向转录组数据（ssRNA-seq data），我们鉴定到2,354个水稻circRNAs。其中，1356个外显子型的circRNA。一些环状RNA表现为组织特异性表达特征。水稻环状RNA还表现出大量的异构体型，包括可变性的反向剪切及正向剪切。我们还发现，多外显子（>10）父母本基因更容易转录产生环状RNA。只有约484个环状RNA从已知的剪切位点反向剪切产生。另外，仅发现92个环状RNA的旁临序列区含有微反向重复转座子（miniature inverted-repeat transposable elements，MITEs)或18-bp的内含子互补序列，显示水稻环状RNA的形成有不同于直接的反向剪切的新机制。水稻环状RNA没有显著miRNA结合位点。我们进一步开展了过量表达环状RNA的转基因实验，发现这些过表达的环状RNA能够降低父母本基因的转录水平，揭示环状RNA以及它的线状型可能负调控其父母本基因的转录表达。这些研究既揭示了水稻环状RNA的广泛存在，也揭示了水稻环状RNA新的生物学功能。该项研究结果发表在RNA（2015, 21: 2076–2087）上, 是水稻转录组研究的一项重要成果。