应用蛋白质组学技术研究皮质醇对斜带石斑鱼肝细胞代谢的影响机制

Stress response in the body by various internal and external environmental factors stimulate the nonspecific systemic reactions, excessive stress can not only cause changes in the metabolism of nutrients in fish, and in turn lead to various diseases, fish farming hazards polelarge. Fish in the state of stress, blood glucocorticoids, especially cortisol levels will change dramatically, and is widely considered to be one of the fish is in stress markers. But cortisol is the most important metabolic organ in fish - What is the function of the liver and its mechanism is not yet clear theoretical support. This topic is intended to coioides primary cultured hepatocytes as test material, non-labeled quantitative proteomics research tools, combined with the results of biochemical markers related to the amount of gene expression changes, research cortisol material metabolism of liver cells impact mechanisms and signaling pathways. The study will further reveal the mechanism of the stress state of fish metabolism, stress physiology studies provide new ideas, and to provide a more solid theoretical foundation for the effective prevention of fish stress.

应激反应是机体在受到各种内外环境因素刺激时所出现的非特异性全身反应，过度的应激不仅可以引起鱼体内营养物质代谢的变化，进而诱发多种疾病，对鱼类养殖业危害极大。鱼类在应激状态时，血液中的糖皮质激素，尤其是皮质醇水平会发生剧烈变化，被公认为是鱼类是否处于应激状态的标志物之一。但是皮质醇对鱼体中最重要的代谢器官--肝脏的功能有何影响及其作用机制尚未有明确的理论支持。本课题拟以斜带石斑鱼原代培养肝细胞为试验材料，以非标记定量蛋白质组学方法为研究手段，结合生化指标与相关基因表达量变化的结果，研究皮质醇对肝细胞物质代谢的影响机制与信号传导路径。本研究将进一步揭示应激状态对鱼类机体代谢的影响机制，为应激生理学方面的研究提供新的思路，为有效预防鱼类应激提供更坚实的理论基础。

近年来，随着动物应激生物学的发展，鱼类应激生物学的研究越来越受到关注。而皮质醇是公认的应激标志物。所以本课题以斜带石斑鱼原代培养肝细胞为试验材料，以定量蛋白质组学方法为研究手段，结合生化指标与相关基因表达量变化的结果，研究皮质醇对肝细胞物质代谢的影响机制。. 通过不同的分离方法和培养条件建立稳定可靠的斜带石斑鱼肝细胞原代培养模型。结果显示，0.25%的胰蛋白酶常温消化法适合斜带石斑鱼肝细胞的分离，最适培养基为L-15培养基，肝细胞在启动原代培养的48-72 h生长代谢旺盛。. 高浓度皮质醇（100、1000 nM）组作用24 h即可导致肝细胞ALT、AST、LDH释放量显著增加（P<0.05），BUN分泌量也显著升高（P<0.05）；当皮质醇浓度为1000 nM时，显著降低了肝细胞的活性（P<0.05）。 . 磷酸烯醇式丙酮酸激酶（PEPCK）和葡萄糖六磷酸酶（G6Pase）的活性和mRNA表达量均随着皮质醇浓度的升高而显著增加（P<0.05），但是糖原合酶（GSase）的活性无显著性变化（P>0.05）。同时，脂蛋白脂肪酶（LPL）和激素敏感脂肪酶（HSL）的mRNA表达量也随着皮质醇浓度的升高而显著升高（P<0.05），而脂肪合成酶（FAS）的mRNA表达量则显著下降（P<0.05）。.在利用蛋白质组学技术研究皮质醇对原代培养斜带石斑鱼肝细胞的影响机制的研究中，对差异蛋白进行生物学信息分析对所获得的差异蛋白进行GO和KEGG转录因子注释分析，一共发现4455个蛋白，其中4372个蛋白可以被注释；对照组与皮质醇处理中有185个蛋白出现差异，其中181个蛋白可以被注释，低浓度皮质醇导致石斑鱼肝细胞中43个蛋白下调，38个蛋白上调，高浓度皮质醇导致石斑鱼肝细胞中48个蛋白下调，34个蛋白上调，与细胞定位、细胞内大分子定位于运输、细胞器的膜损伤、胞内酶的催化活性等蛋白差异显著。