植物分泌体的蛋白质组与功能

Little is know about the molecular mechanisms of plant exocytosis. We have recently used a green fluorescent protein (GFP) fusion approach to study the transport pathways of plant exocytosis and demonstrated for the first time the existence of two independent pathways of protein secretion in plant cells. An ER-Golgi-TGN-PM pathway is defined by the traffic of the rice secretory carrier membrane protein 1 (SCAMP1), while a novel cytosol to PM unconventional secretion pathway is mediated by a novel organelle termed EXPO (exocyst-positive organelle). These EXPO, defined by a GFP fusion with the Arabidopsis Exocyst protein 70E2 (AtExo70E2-GFP), are distinct from all known organelles in the plant endomembrane system. EXPO fuse with the PM releasing a single membrane vesicle into the cell wall along with a cytosolic protein S-adenosylmethionine synthetase 2 (SAM2) functioning in cell wall (CW) biosynthesis. EXPO are also found in other cell types including root tips, root hair cells and pollen grains. EXPO thus represents a form of unconventional secretion unique to plants. Therefore, the goal of this proposal is to study the molecular components of EXPO and function in plants. First, using transgenic Arabiodpsis cell line expressing AtExo70E2-GFP and Spinning Disk Confocal Microscope, we will study the EXPO dynamics and EXPO-PM fusion in living cells. Second, using subcellular fractionation and affinity purification, we will isolate EXPO for proteomic LC-MS/MS analysis and protein identification. Third, using both loss-of-function and gain-of-function approaches in transgenic Arabidopsis plants, we will study the possible functions of selective newly identified EXPO proteins in cell wall biogenesis, plant defense and EXPO biogenesis. Our study will shed light on the molecular mechanisms of EXPO-mediated plant exocytosis and possible roles in cell wall biosynthesis and plant stress response or defense. These are important topics for bioenergy development and plant biotechnology.

我们最近的研究发现了一种新的植物细胞器，它可由AtExo70E2-GFP融合蛋白来界定。该细胞器参与由细胞质到质膜的非传统分泌功能，我们因此将它命名为分泌体。分泌体可与质膜融合，并将含有参与细胞壁生物合成的蛋白质的单层膜囊泡释放到质膜外（质外体）。因此，本研究的目标是阐明该分泌体的分子组成及在植物中的功能。首先，采用表达AtExo70E2-GFP的转基因拟南芥细胞系和转盘式共聚焦显微镜，我们将研究该分泌体的动力学及其与质膜的融合过程。第二，通过亚细胞分级分离与亲和纯化技术，我们将分离分泌体进行蛋白质组分析与蛋白识别。第三，利用在转基因拟南芥植物中的功能获得和功能缺失分析，我们将研究新识别的分泌体蛋白在细胞壁合成、植物防御应答与分泌体生物形成过程中的功能。本研究将阐明该分泌体调节的植物胞吐作用的分子机理，及其在细胞壁合成与植物抗逆应答中可能的作用。这有助于生物能源与植物生物技术的研究与发展。

目前我们对于植物胞吐途径的分子机制尚且缺乏。我们最近的研究发现了一种新的植物细胞器，它可由AtExo70E2-GFP融合蛋白来界定。该细胞器参与由细胞质到质膜的非传统分泌功能，我们因此将它命名为分泌体。分泌体可与质膜融合，并将含有参与细胞壁生物合成的蛋白质的单层膜囊泡释放到质膜外（质外体）。因此，本研究的目标是阐明该分泌体的分子组成及在植物中的功能。首先，采用表达AtExo70E2-GFP的转基因拟南芥细胞系和转盘式共聚焦显微镜，我们研究该分泌体的动力学及其与质膜的融合过程。第二，通过亚细胞分级分离与亲和纯化技术，我们分离分泌体进行蛋白质组分析与蛋白识别。第三，利用在转基因拟南芥植物中的功能获得和功能缺失分析，我们研究新识别的分泌体蛋白在细胞壁合成、植物防御应答与分泌体生物形成过程中的功能。本研究发现EXPO分泌体标记物Exo70E2是EXPO分泌体形成的必需基因。Exo70E2负责招募分泌复合体亚基到EXPO分泌体, 另外也完成了EXPO分泌体的运动动力学研究，揭示EXPO分泌体的运动模式不同于其他细胞器，并与细胞微管与微丝均相关。此项研究阐明该分泌体调节的植物胞吐作用的分子机理，及其在细胞壁合成与植物抗逆应答中可能的作用。通过本项目的研究，我们进一步丰富了植物细胞的蛋白分泌途径，对EXPO分泌体所代表的非传统分泌途径有了更深的认识。由于植物细胞内存在大量通过非传统途径分泌的蛋白，而EXPO分泌体介导的由细胞质到质膜的胞吐途径对于参与细胞壁生物合成的外泌蛋白的运输是非常重要的。因此，本项目的研究成果对于进一步认识植物细胞壁的生物合成，以及在此基础上深化对生物能源的开发利用也具有重要意义。此外，本项目的研究成果显示EXPO分泌体与自噬体在特定条件下存在关系，而近期的研究表明自噬体在植物抗逆、抗病过程中均具有重要的作用。因此，本项目的研究成果对于农作物抗逆、抗病能力的研究也具有一定的理论及实践指导意义。