跨损伤DNA合成通路REV3L基因对宫颈癌细胞放疗、化疗敏感性影响的研究

The REV3L gene,encoding the catclytic subunit of human polymerase ζ,plays a significant role in the cytotoxity,mutagenicity,and resistance to DNA damaging agents of certain tumors.Our clinical study showed that the polζ-positive group had significantly shorter progression-free survival (PFS) by Kaplan-Meier survival estimates (P=0.011) in 123 cervical cancer patients with chemoradiation therapy after radical surgery. The resistance to chemoradiation posed a major impediment that contributed to inevitable tumor recurrence and progression. It suggested that Polζ protein expression can be used as predictors for chemoradiation sensitivity and prognosis in cervical cancer patients. However,the intrinsic and acquired chemoradiation resistance mechanism needs further exploration.We hypothesize that REV3L gene probably plays an improtant repair role in the DNA damage induced by chemotherapy or radiation therapy in cervical cancer cells, and it endows the cells with chemoradiation resistance. In this study, we plan to examine the expression of REV3L in normal cervical tissues and cervical cancers. We will generate REV3L-overexpression clones by transfection of cDNA, and suppression of REV3L expression by RNA interference (RNAi). Then,treatment with indicated concentrations of chemotherapeutic drugs and doses of X-ray irradiation will be used to test the response after upregulation or downregulation of REV3L.Thus, we can explore the role of REV3L in regulating the sensitivity of cervical cancer cells to chemoradiation and potential mechanisms related with apoptosis. To our knowledge,this is the first study that investigates the role of REV3L as a key molecular target in the radiotherapy and/or chemotherapy sensitization in cervical cancer to develop more effective therapeutic regimens.

REV3L基因为跨损伤DNA合成途径中的关键基因，参与DNA自身修复，能提高细胞对DNA损伤剂杀细胞效应的抵抗性，并产生一定程度的耐受。我们的前期研究显示REV3L基因表达产物pol ζ在宫颈癌患者中具有推测放、化疗敏感性及预后的作用，但其作用机制还有待进一步探讨。为此，我们推测REV3L基因很可能在宫颈癌细胞修复化疗药物及放射线引起的DNA损伤中起重要作用，使细胞对化疗药物耐药及放射线抗拒。为验证这一假说，我们拟将癌细胞中REV3L基因沉默或过表达后，采用不同剂量的化疗药物和X射线处理细胞，观察化、放疗联合REV基因改变对癌细胞增殖及凋亡的影响。探讨如何提高宫颈癌放、化疗的敏感性及其作用机制。本研究首次探讨跨损伤DNA合成通路中关键基因REV3L在宫颈癌放、化疗增敏中作为分子靶点的价值，为建立新的分子靶向治疗联合放化疗模式提供重要依据。

宫颈癌的发病率居发展中国家女性恶性肿瘤的第二位，居全球第四位。REV3L 是 DNA 聚合酶 ζ(Polζ)的催化亚基,在跨损伤 DNA 合成通路中起关键作用。本课题旨在通过检测宫颈癌和正常宫颈组织REV3L的蛋白表达，结合宫颈癌放化疗患者的病理及预后资料，阐明REV3L基因表达是否与宫颈癌患者放化疗敏感性相关；并进一步研究宫颈癌细胞株REV3L 基因敲除或过表达后对化疗药物及X射线敏感性的变化，探讨REV3L基因在放化疗中作为分子靶点的价值及其机制。.实验结果显示Polζ在宫颈癌组织及正常宫颈组织中的蛋白表达差异有统计学意义（p=0.034）。宫颈癌细胞系 Hela 和 Siha 中，REV3L mRNA 表达水平较 ME180 及 MS751 细胞系高。对 Hela 和 Siha 进行了REV3L基因沉默，对 MS751 和 ME180 进行了基因过表达，real time PCR 及 RT-PCR 结果验证了沉默及过表达效果，并且REV3L 基因沉默或过表达对 REV7L mRNA 表达无明显影响。.进一步实验结果发现，REV3L 沉默后抑制宫颈癌细胞系增殖，通过 G1/S 期阻滞抑制细胞周期进展，细胞平板克隆形成率少，对顺铂的敏感性增加，顺铂处理后早期凋亡率增加， DNA 损伤程度加重；而过表达则促进宫颈癌细胞系增殖，可以越过 G1/S 期细胞周期检查点促进细胞周期进展，并且细胞克隆形成率增加，对顺铂的耐受性增加，顺铂处理后早期凋亡率减少，DNA损伤减轻。线粒体介导的细胞凋亡通路参与介导了细胞 REV3L 基因对顺铂的敏感性变化的调节。.REV3L 基因沉默使宫颈癌细胞株对X射线的敏感性增加，细胞平板克隆形成率明显减少，呈剂量依赖性。细胞有氧呼吸和糖酵解检测结果表明，REV3L 基因沉默后细胞的有氧呼吸能力及糖酵解能力均明显降低。real time PCR检测REV3L沉默对代谢相关基因的影响，结果发现SIRT1基因转录水平在REV3L沉默后明显降低。.以上结果说明REV3L可以作为潜在的靶点用于宫颈癌放化疗的增敏。更多增敏机制及REV3L在体内是否具有同样的作用需要进一步实验探索。