酪氨酸激酶Pyk2对小鼠着床前胚胎细胞增殖和存活的影响

Pyk2是一种非受体酪氨酸激酶，参与细胞迁移、粘附、增殖、分化、凋亡等多种生理过程。我们以前的研究工作中发现Pyk2在小鼠卵母细胞减数分裂成熟、受精及早期胚胎发育的过程中表达，在着床前的胚胎细胞中Pyk2除分布在细胞质中外，更多地聚集在细胞核中和凝集的染色体上。为了阐明这种定位的本质，揭示Pyk2在着床前胚胎发育过程中的作用机制，本课题拟采用RNA干涉、免疫荧光定位、实时荧光定量PCR、Western-blot等技术研究Pyk2对小鼠着床前胚胎细胞增殖和存活的影响，探索Pyk2对早期胚胎中表达的重要转录因子和DNA甲基化、组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化等表观遗传修饰可能具有的调节作用。本研究对阐明酪氨酸激酶在早期胚胎细胞增殖中的作用，揭示胚胎细胞增殖和发育的分子机制具有重要的意义，同时也为克隆和辅助生殖技术的完善提供理论借鉴。

与原计划书比较，本研究完成了大部分研究内容，包括Pyk2及其磷酸化形式在小鼠早期胚胎发育过程中的定位、Pyk2mRNA在小鼠早期胚胎发育过程中的表达、RNA干扰系统的建立、Pyk2siRNA下调其表达后对早期胚胎发育的影响等，取得了一定的研究成果。另外，在现有条件下，在原计划的基础上，对研究内容进行了拓展，对Pyk2在小鼠卵母细胞减数分裂成熟过程中的定位及功能及FAK在小鼠卵母细胞成熟、受精及早期胚胎发育中的定位及功能进行了进一步的探索。. Pyk2是粘着斑激酶家族(focal adhesion kinase family，FAK family)的成员，它属于非受体型酪氨酸蛋白激酶。黏着斑激酶家族的成员包括 Pyk2和FAK。Pyk2和FAK在卵子中表达量都相对较高，但是其在卵子成熟受精及胚胎发育过程中的机制却了解不多。本研究应用共聚焦显微术、Westernblot、RNAi、抑制剂干扰、实时荧光定量PCR等方法研究了Pyk2及FAK在小鼠卵子成熟、受精及胚胎发育过程中的定位、分布及可能具有的功能。发现在小鼠卵子成熟过程中p-Pyk2与γ-tubulin存在共定位关系，可能通过调节γ-tubulin的磷酸化来参与了微管的聚合及纺锤体的组装。在受精和胚胎发育过程中，Pyk2主要定位于精子的头部、皮质及受精卵和胚胎的细胞核及细胞质中，用RNAi下调Pyk2的表达后，可以一定程度上抑制胚胎细胞的增殖，降低其发育率，Pyk2可能参与了小鼠精子入卵和早期胚胎发育的调控。本文还对FAK在卵母细胞和早期胚胎发育过程中的定位及功能进行研究。发现FAK以及pY397FAK、pY576/577FAK定位在卵母细胞的皮质部位；在受精卵及2、4、8细胞各时期，FAK在皮质部位及细胞核中定位，在细胞与细胞的连接处有弱分布；在桑葚胚和囊胚时期，FAK定位于细胞的顶部及基底部以及细胞与细胞的连接处和细胞核中。本研究发现一定程度上阐明了FAK家族激酶在小鼠卵子成熟、受精和胚胎发育过程中的定位及可能的功能，揭示哺乳动物卵子成熟及胚胎发育机制，为深入研究此过程提供借鉴。