VP41蛋白在Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒感染过程中的作用机制研究

Grass carp reovirus (GCRV)is the main viral pathogen that damage grass carp cultivation industry. So far, grass carp reovirus strains isolated in China can be divided into several genotypes. genotype Ⅱ grass carp reovirus encodes a particular protein VP41, which cannot find its homologous protein in another two genotypes grass carp reovirus. It is very possible that VP41 protein is one of the important factors that decide the specific biological characteristics of typeⅡgrass carp reovirus. The function of VP41 protein is still unclear. Therefore, our project will first identify VP41 protein is structural or nonstructural protein by mass spectrographic analysis and western blot. Then the localization of VP41 in cell and viral factories, and the interactions between VP41 and the other viral proteins will be confirmed by immunofluorescence, gold-IIEM analysis, Co-Immunoprecipitation and Far-Western blotting. In further study, the virus replication changes caused by VP41 suppression will be determined by RNA interference technique. It will help us to understand the progress of grass carp reovirus infection according to reveal the molecular mechanism of VP41 protein in virus assembly and replication, and lay theoretical foundation for prevent and treat grass carp hemorrhagic disease effectively.

草鱼呼肠孤病毒（GCRV）是危害草鱼养殖的主要病毒性病原，其感染和致病机制一直备受关注。目前国内草鱼呼肠孤病毒分离株可被划分为多种基因型，其中Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒编码一个特有的蛋白VP41，在其他基因型中尚未发现。VP41蛋白很有可能是决定Ⅱ型草鱼呼肠孤病毒生物学特性不同于其他基因型的重要因素，而对于VP41蛋白的功能目前仍不清楚。本项目拟通过质谱分析和western blot鉴定VP41蛋白是否为结构蛋白，然后利用免疫荧光、免疫电镜、免疫共沉淀和Far-Western blotting技术，确定VP41蛋白在细胞中的定位、是否参与病毒包涵体形成、以及与VP41相互作用的病毒蛋白，最后采用RNA干扰抑制表达技术，研究VP41蛋白抑制表达对病毒复制的影响。弄清VP41蛋白在病毒装配和复制中的作用机制，将有助于认识草鱼呼肠孤病毒感染的发生过程，为有针对性的防治草鱼出血病奠定理论基础。

本项目利用免疫荧光技术，检测了VP41蛋白和病毒包涵体基本结构形成蛋白NS79在细胞内的定位，VP41蛋白和NS79蛋白单独表达时，VP41蛋白定位在细胞质中，呈块状分布，NS79蛋白在细胞质内聚集成圆形的团块结构，能形成病毒包涵体的基本结构。将两个蛋白共表达后，显示VP41蛋白和NS79蛋白共定位于细胞质中，表明NS79蛋白能够招募VP41蛋白进入病毒包涵体的基本结构，两者有相互作用。本项目还设计了三种抑制VP41表达的siRNA，并对其抑制效果进行了检测，其中两种能够明显抑制VP41基因的表达，对于VP41蛋白被抑制后对病毒扩增能力的影响，正在实验检测中。另外本项目针对GCRV的外衣壳蛋白VP35和VP56构建了DNA疫苗和亚单位疫苗，将VP35基因构建到了pcDNA-3.1载体，构建成的载体能够成功在细胞内表达重组VP35蛋白，将此重组表达质粒作为DNA疫苗；同时将VP35蛋白和VP56蛋白表达基因分别构建到了pET-32a表达质粒，并且在体外成功表达两种重组蛋白，将表达的重组蛋白作为亚单位疫苗。以上三种疫苗均能引起草鱼的抗病毒免疫反应，血液中白细胞数量发生明显升高，血液中产生了抗病毒抗体，抗病毒的相关基因表达明显上调，三种不同疫苗均具有较好的免疫保护，相对免疫保护率在60%以上，最高在75%。以上研究结果对于理解草鱼呼肠孤病毒的致病机制以及对草鱼出血病的免疫防控具有重要意义。