Smurf和Arkadia对病理性瘢痕TGF-β1信号转导的影响及其机制研究

泛素-蛋白酶体通路中Smurf(Smad泛素化调节因子)和Arkadia通过泛素化修饰信号转导蛋白调控TGF-β1活性，新近研究表明其表达异常直接影响TGF-β1信号转导，并参与纤维化的发生发展。但是在病理性瘢痕中的表达和调控作用尚未见报道。本课题拟在预初实验的基础上，以病理性瘢痕及其成纤维细胞为研究对象，检测Smurf和Arkadia的表达，研究其与瘢痕形成的相关性；再通过质粒转染过表达，以及siRNAs技术阻断Smurf和Arkadia表达，探索Smurf和Arkadia对病理性瘢痕成纤维细胞生物学行为和TGF-β1信号转导的影响；并运用蛋白酶体抑制剂MG132，利用蛋白降解、泛素化活性的体外检测方法和免疫沉淀技术，探讨Smurf和Arkadia对TGF-β1信号转导通路影响的分子机制。本课题如能完成，可望为探索病理性瘢痕的发病机制开拓新思路，并为病理性瘢痕治疗提供一个新的分子靶点。

增生性瘢痕主要表现为损伤部位成纤维细胞的异常增生及大量的细胞外基质成分合成和沉积等。TGF-β1在这一病理过程中起着关键性的作用。TGF-β1通过细胞内Smad分子通路发挥作用。最近研究发现，泛素-蛋白酶体途径是一个调节蛋白质降解与功能的重要系统。泛素-蛋白酶体途径中E3泛素连接酶能够促进泛素蛋白对靶蛋白进行选择性泛素化标记，最后引起降解。E3泛素连接酶Arkadia和Smurf2通过选择性介导TGF-β1信号传导通路中关键组分的泛素化降解，在TGF-β1/Smads信号活性的调节中起枢纽作用，一旦功能失调，会导致异常的TGF-β1/Smads信号传导，并引起一系列疾病的病理生理学改变。但是，对于Smurf2和Arkadia在增生性瘢痕中表达，目前尚未见报道。本研究通过体外培养增生性瘢痕成纤维细胞，以正常皮肤成纤维细胞做为对照，检测Smurf2和Arkadia的表达，结果发现，增生性瘢痕成纤维细胞中Smurf2表达增强，而且在TGF-β1刺激下，瘢痕成纤维细胞中Smurf2表达逐渐增加；增生性瘢痕成纤维细胞中Arkadia mRNA表达高于正常皮肤，蛋白表达水平无差异。进一步使用Smurf2 siRNA转染到瘢痕成纤维细胞，结果在转染后48h，成功抑制了Smurf2的表达，然后检测自分泌TGF-β1的变化、I型胶原的合成和a-SMA的表达，结果发现：使用Smurf2 siRNA敲除Smurf2基因表达后，瘢痕成纤维细胞自分泌TGF-β1减少、TGF-β1刺激的I型胶原合成减少、a-SMA表达减少。这些研究结果表明，Smurf2参与了瘢痕增生的过程。.在TGF-β1刺激下，增生性瘢痕成纤维细胞中Smad7蛋白和SnoN/Ski蛋白水平减少，但是其 mRNA水平却增加，进一步运用蛋白酶体抑制剂MG132，利用蛋白降解和泛素化活性的体外检测方法和免疫共沉淀技术，结果显示，Smurf2可能通过泛素化降解Smad7和SnoN/Ski，关于其调控TGF-β1信号转导的确切机制，需要进一步研究证实。本项目明确了泛素化调节因子Smurf2和Arkadia在增生性瘢痕中的表达差异，并初步探索了Smurf2对增生性瘢痕成纤维细胞中TGF-β1/Smad信号转导通路的调控机制，从蛋白质泛素化角度研究瘢痕的发病机制，为增生性瘢痕发病机制开辟新的研究领域，为增生性瘢痕的防治开拓新思路。