microRNAs功能网络调控蜜蜂咽下腺泌浆生理机制研究

The orchestration of hypopharyngeal glands (HGs, the principal site of royal jelly synthesis and secretion) function requires complex gene regulatory networks and nutritional metabolism regulation that modulated, in part, by microRNAs (miRNAs). The miRNAs have been functionally known in translational repression, however, their repertoire in HGs is poorly characterized. Here, two set of miRNA isolated from the bees that generated from reciprocal crosses using high (A. m. ligustica, female parent) and low (A. m. carnica, male parent) with contrast performance of royal jelly are using to uncover the contribution of miRNAs. We aimed to characterize the dominated miRNAs and their target genes located in loci associated with royal jelly synthesis and secretion using the anti-sense inhibition and overexpression combined with qPCR, western blot and dual-luciferase reporter system validation. Overall, our study expects to illustrate the expression profile and pathway network implicated in the regulation of miRNAs, therefore the results may have contributed to the miRNAs research, as well as the molecular mark assisted breeding on honeybee.

蜂王浆合成和分泌涉及到复杂的基因表达和营养代谢调控，研究其分子调控机制是揭示蜂王浆产量差异以及促进分子育种的重要前提。已有研究表明，蜂王浆中存在丰富的microRNAs（miRNAs）表达，提示它可能参与蜂王浆合成与分泌的调控。本研究以王浆高产和低产杂交后代蜜蜂的咽下腺为研究对象，获得与王浆性状相关的高通量miRNAs表达模式以及靶标基因注释信息，通过细胞水平反义抑制和过表达干预，利用定量PCR、Western blot、双荧光素酶报告系统，确定主效应miRNAs及其靶基因关联的转录因子细胞定位、作用方式及分子机制相关的下游互作元件表达调控特性，构建miRNAs参与的分子调控网络，阐明蜜蜂王浆性状调控的分子机理。本研究结果不仅能够揭示泌浆的miRNAs作用机制，同时也对指导蜜蜂的分子标记辅助育种具有一定参考价值。

我国是世界第一养蜂大国，生产的蜂王浆占全球市场的90%以上，在世界蜂王浆市场中占有举足轻重的地位。蜂王浆是青年工蜂头部咽下腺和上颚腺共同分泌的饲喂蜂王和幼虫的成分复杂的天然营养物，具有多种生物学功能。蜂王浆合成和分泌涉及到复杂的基因表达和营养代谢调控，研究其分子调控机制是揭示蜂王浆产量差异以及促进分子育种的重要前提。.研究表明，蜂王浆中存在丰富的miRNAs，提示它可能参与蜂王浆合成与分泌的调控，也可能参与蜜蜂的生长发育。本研究以王浆高产和低产杂交后代蜜蜂的咽下腺为研究对象，获得与王浆性状相关的高通量miRNAs表达模式以及靶标基因注释信息，获得主要结果如下：.（1）蜜蜂单雄受精正反交组配构建蜂群，后代王浆性状出现差异，倾向于母本性状。.（2）在以意蜂为母本的杂交后代蜂群（E×K）中，开展miRNAs测序，获得43M的reads数，平均测序深度为5.86×。.（3）分析获得已知miRNA共154个，具有差异显著性miRNA 34个，其中上调表达20个，下调表达14个；尚未注释的miRNA共171个，具有差异显著性miRNA 27个，其中上调表达19个，下调表达8个。.（4）Pathway富集分析筛选到钙信号通路、Rap1信号通路、PI3K/AKT信号通路、Wnt信号通路、核糖体通路和代谢通路等差异表达基因中显著性（q值<0.05）富集的Pathway。.（5）差异表达miRNAs与gene12399、gene5777、gene10502、gene5125、gene11222、gene2581等这6个靶基因具有强烈的互作关系，表明其对王浆性状的调控可能是通过与靶基因转录后调控的作用机制。因此，miRNAs的功能主要由其靶向调控的基因功能来体现。.（6）对意大利蜜蜂咽下腺形态发育及活性的分子调控，发现9日龄工蜂咽下腺腺泡直径最大，粗面内质网最丰富，分泌活性最高；蛹期显微注射ame-miR-184可通过抑制靶基因InR2和CDK12的表达，抑制线粒体代谢关键酶基因的表达，导致王浆主蛋白的合成降低；成蜂显微注射ame-miR-184可抑制咽下腺靶基因InR2和CDK12的表达，下调蛋白合成相关基因TOR和Eif4g的表达，影响细胞内蛋白质的合成。.本研究构建了miRNAs参与的分子调控网络，阐明了蜜蜂王浆性状调控的分子机理，获得的分子标记在分子辅助育种具有潜在的应用价值。