水稻广谱抗稻瘟病基因Pi47和Pi48的精细定位和克隆

前期研究已从持久广谱抗稻瘟病的湖南地方品种湘资3150中鉴定到2个主效抗性基因Pi47和Pi48。目前已获得与Pi47连锁距离分别为1.36和0.68cM的标记RM224和K136，与Pi48共分离的标记LY-2。本项目采用Pi47、Pi48单基因系与感病亲本CO39杂交建立抗感表型分离F2大群体，利用已公布的水稻基因组序列数据库信息和筛选BAC文库阳性克隆测序分析相结合的方法，通过开发SSR和CAPS标记逐步精细定位目标基因；通过对湘资3150BAC文库进行菌落原位杂交筛选，建立阳性克隆重叠群，整合物理图谱和遗传图谱；在利用生物信息学软件预测候选基因的基础上，采用酶切方法或Long-range PCR法将目标DNA片段亚克隆到双元载体，并通过转基因技术将候选基因转到感病品种验证基因功能；采用RACE获得全长cDNA并分析基因结构及其与抗性功能的关系；利用RT-PCR技术分析基因表达特征。

不断挖掘和利用稻瘟病抗性基因是培育持久广谱抗病水稻新品种的关键技术。本项目组从广谱持久抗稻瘟病的湖南地方品种“湘资3150”中鉴定到2 个抗性基因Pi47 和Pi48，并进行了初步定位。本项目在此研究基础上，开展了如下研究:.1）Pi47基因的精细定位。利用CO39/湘资3150RIL中只含有Pi47的单基因系与CO39构建BC2群体，将Pi47精细定位于CAPS标记S32与K33之间，遗传距离分别为0.21cM与0.03cM，并与S10共分离。构建了RM224至K134之间包含Pi47基因区域由5个重叠克隆构成的物理图谱，经预测发现该区段含有10个基因，其中有4个NBS-LRR类似R基因。.2）Pi47基因的克隆。采用与Pi47基因连锁标记S10及侧翼标记S32、K33通过PCR混合池筛选法获得Pi47基因所在区域BAC克隆。以该BAC克隆为基础构建了一个适于水稻转化BIBAC载体。利用日本晴作为转基因受体进行了转化，目前已获得独立阳性转基因水稻株系10个，并已获得T1代种子，转基因水稻接种表型鉴定工作正在进行。.3）Pi48基因的精细定位。从湘资3150/CO39RIL中选择4个Pi48单基因系与CO39构建BC2分离群体，将Pi48基因精细定位于LY-33和LY-56之间，与LY-48、LY-51共分离。组装了日本晴参考基因组在这两个标记之间的BAC重叠群，发现日本晴基因组中这两个标记之间的物理距离大约436.1kb。基因注释表明该区段编码20个基因，其中ORF6和ORF7编码两个NBS-LRR 类似抗病基因。ORF6在抗、感病亲本中扩增产物差异明显，因此重点选择ORF6作为Pi48的最终候选基因。.4）Pi48候选基因克隆及表达载体构建。ORF6在湘资3150中编码区基因组序列全长5209bp，编码结构含有4个外显子和3个内含子。ORF6基因编码蛋白与抗病基因Pita蛋白序列相似性很高，N端810个氨基酸完全一致，而810-1033位的氨基酸表现出高度差异。利用长片段扩增高保真酶克隆后，通过SmaI和HindIII双酶切，将Pi48基因全长基因组DNA约7500bp的扩增片段克隆进植物表达载体pCAMBIA1301中，用于Pi48基因功能互补测验转基因水稻构建。目前，正在利用农杆菌介导转化法，转化粳稻品种日本晴和籼稻品种CO39。