石斑鱼新型摄食因子的克隆鉴定及其对肌肉糖代谢的调控作用

本项目将开展新型摄食因子开胃肽（orexin）对鱼类糖代谢的调控机制研究，在对斜带石斑鱼的orexin及其受体的基因进行克隆、序列分析和基因时空表达特性研究的基础上，制备orexin及相关调控因子的重组蛋白。通过在体和离体试验，从分子水平上探索鱼类摄食因子对糖的代谢和平衡调控机理，阐明石斑鱼orexin与胰岛素样生长因子-I（IGF-I）在肌肉糖代谢过程中的相互作用关系，揭示orexin和IGF-I对糖代谢进行调控的信号传导机制，为鱼类营养学和生理学提供新的内容，为进一步透彻研究鱼类代谢平衡的内分泌机理、更有效调控摄食、提高饵料利用率，降低养殖成本，减少养殖水体中残留饵料，促进鱼类养殖产业向绿色产业发展提供新的理论基础。

食欲素(orexin)是一种由下丘脑分泌的神经调节肽，被认为是一种新型的摄食因子。本研究主要研究结果如下：1）．斜带石斑鱼存在两种形式的OX2R全长cDNA序列，命名为gpOX2RL和gpOX2RS。gpOX2RL cDNA全长1440bp，编码一个375氨基酸的七次跨膜蛋白；而gpOX2RS 为新发现的OX2R剪切体，其cDNA全长855bp，编码一个214氨基酸的四次跨膜蛋白。Southern Blot实验结果表明斜带石斑鱼OX2R在基因组中为单拷贝基因。2）．斜带石斑鱼orexin及OX2R基因在所检测的神经组织和外周组织中广泛表达，在中枢神经系统高表达，外周组织低表达，表明中枢神经系统是斜带石斑orexin/OX2R发挥其生理功能的主要作用区域。Northern blot研究结果表明，石斑鱼下丘脑中只检测到OX2RS转录本；Western blot研究结果也表明石斑鱼中脑及下丘脑中OX2RS蛋白的相对表达量要高于OX2RL，并且两种OX2R在胚胎发育中可能具有不同的功能。3）斜带石斑鱼下丘脑orexin mRNA存在着明显的昼夜节律，夜间表达量最低，显著性地低于日间表达水平；且orexin mRNA表达量在摄食点显著上升，暗示在石斑鱼中orexin可能作为一个饥饿信号起始摄食。斜带石斑鱼腹腔注射orexin-A能显著促进下丘脑NPY mRNA的表达。离体孵育实验也表明， orexin-A显著性地刺激下丘脑碎片中NPY mRNA的表达。NPY启动子活性实验的研究表明NPY启动子上游1003 bp碱基是orexin调节NPY基因启动子的重要功能区域。4）．构建带绿色荧光蛋白标签的重组斜带石斑鱼OX2RL和OX2RS载体，分别转染至293T细胞，证明绿色荧光信号主要定位在细胞膜上。CRE荧光素酶报告基因与真核重组表达载体pcDNA3.1-OX2RL或者pcDNA3.1-OX2RS共转染293T细胞，结果显示OXA结合两种受体不激活PKA信号通路， 但能显著抑制OXA激活的ERK和p38-MAPK信号通路，说明OXA结合两种受体经PLC/PKC通路激活ERK和p38-MAPK信号通路，新型的OX2RS也是功能性受体。orexin对葡萄糖转运、糖酵解和糖异生具有调控作用。投喂实验结果表明orexin重组蛋白可通过增强鱼体对糖类的利用而促进鱼体的生长。