基于M13工程噬菌体的微悬臂梁重金属离子传感器的研究

Heavy metal pollution has been an increasingly global problem for its danger to human health and to the environment. Traditional methods for detection of heavy metal ions are not suitable for on-spot application. Based on a newly develeped high quality-factor in-plane-mode resonant cantilever sensor for real-time bio/chemical detection in liquids, we will develop a nature nano-material (genetic engeered M13 bacteriophage) as the sensitive materials on the cantilever to detect the trace heavy metal ions in liquid. Metallothioneins, a family proteins with unclear biological function, have the capacity to bind heavy metal ions. Blast the amino acid sequence of the metallothioneins and select the conserved 5 peptides which possibly bind the heavy metal ions. Synthesis of DNA fragments with the sequence coding for 5 peptides in the P8 N-terminus and replace corresponding fragments into the genome of the M13 bacteriophage. The genetically engineered M13 bacteriophage would generate corresponding 5 peptides on their surface. Because of the largest heavy metal ion binding surface, the engineered M13 baceriophage could binds the ions as much as possible. With the high sensitive microcantilever, high selective and binding capability of the engineered M13 bacteriophage, we should develop the sentive, on spot biosensor for heavy metal ion detection .The research will also extend the ion binding capacity of the metallothioneins in vivo.

重金属污染问题日趋严重，传统的重金属离子检测方法不能满足快速现场检测的需求。基于本课题组最近研制的能够在液相环境中工作的谐振式微悬臂梁高灵敏度质量型传感器，本研究首次尝试使用生物纳米材料-工程噬菌体作为特异性结合重金属离子的敏感层，发展一套对环境中痕量重金属离子快速、准确检测的新方法。利用金属硫蛋白特异性结合重金属离子的性质，通过分析比对蛋白质、核酸数据库中金属硫蛋白序列，初步筛选出可特异性结合重金属离子的保守5肽序列。应用M13噬菌体展示技术，在全部P8蛋白N末端融合表达这些5肽，构建工程噬菌体。这些工程噬菌体表面是一层金属硫蛋白5肽的单分子层，因此能够最大限度地特异性吸附重金属离子。应用谐振式微悬臂梁传感器筛选出与单一重金属离子特异结合的工程噬菌体，制造快速、灵敏、简便的可用于现场检测重金属离子的生物传感器。并丰富极具市场应用价值的金属硫蛋白与重金属离子结合活性的体外研究。

本项目通过基因工程的方法改造了M13噬菌体，在噬菌体表面p8蛋白融合表达具有重金属离子结合活性的五肽。通过分析文献资料以及基因数据库中金属结合蛋白及其DNA序列并筛选出十组有代表性的保守五肽，并根据密码子偏好性质优化成为可以在大肠杆菌-噬菌体系统中容易表达的DNA序列。构建了便于噬菌体展示基因操作的过渡克隆载体质粒pSK-P8P3，该质粒含部分M13噬菌体的基因序列，并且具有方便分子克隆操作的限制性内切酶切割位点。最终将这些编码多肽的DNA序列位点特异性引入到M13噬菌体基因组编码表面蛋白P8的基因序列中得到工程噬菌体。并以此生物纳米材料作为重金属离子结合的直接敏感层，二氧化硅纳米介孔材料作为增加生物材料固定量的增强层，新研制的气/液界面谐振的高灵敏度谐振式微悬臂梁作为质量传感平台，通过微电子微机械兼容制造技术以及化学、生物学修饰技术结合制作成便携式重金属离子传感器。其中融合表达HSQKV的工程噬菌体与镉离子结合能力强，M13噬菌体经化学偶联修饰该多肽后与镉离子的结合能力仅为工程噬菌体的0.05倍。该工程噬菌体与铅离子有一定交叉反应，然而与其它金属离子交叉反应很小，在选择性上优于常见的化学类传感器。这为功能性生物纳米材料的开发奠定了坚实的基础。