EPO调控心肌细胞SERCA2a 表达及其对糖尿病心肌病防治作用的机制研究

Diabetic cardiomyopathy(DCM) is one of the common chronic complications of diabetes mellitus(DM). Myocardial systolic and diastolic dysfunction is the first stage of DCM and then leads to congestive heart failure. Endoplasmic reticulum (ER) stress induced by DM, leading to irregular expression of sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a ( SERCA2a) is one of the important mechanisims of impaired cardiac contractility and relaxation of the myocardium due to altered Ca2+ homeostasis. However, there is no clinical effective treatment on DCM. Our previous study observed that EPO improved the cardiac dysfunction in DCM, but the exact mechanisms are not elucidated. It was found recently that erythropoietin (EPO) mitigated the progressive cardiac dysfunction through attenuating ER stress,but the effects of EPO on SERCA2a and Ca2+ handling have not been reported. In the present study, we aimed to observe the expression of ER stress markers and SERCA2a, the Ca2+ transient, cardiac contractility and relaxation of the myocardium and cardiac function with EPO intervention in glucose incubated cardiomyocytes and diabetic rats to determine the role of EPO as a new therapeutic strategy for DCM through attenuating ER stress, modulating SERCA2a expression, improving Ca2+ handling and cardiac dysfunction.

糖尿病心肌病是糖尿病常见的慢性并发症，主要表现为心肌收缩舒张功能障碍、导致充血性心衰，其发生机制可能与"糖尿病诱发心肌细胞内质网应激，导致心肌浆网Ca2+ ATP酶2a（SERCA2a）蛋白表达下调，引起心肌细胞钙稳态失衡造成心脏收缩舒张功能异常"有关，该疾病临床尚缺乏有效的防治手段。 本课题组前期工作发现促红细胞生成素（EPO）可以改善糖尿病心肌病的心功能，但其具体机制尚不明确。近来文献报道：EPO有减轻内质网应激，改善心功能的作用，但EPO对心肌细胞SERCA2a表达及钙转运的影响未见报道。 本项目将以高糖孵育心肌细胞和糖尿病心肌病大鼠为研究模型， 观察EPO干预对心肌细胞内质网应激、SERCA2a表达水平、钙浓度变化、心肌细胞收缩舒张功能和心功能的影响，探讨EPO保护糖尿病心肌、改善心功能的机制，为糖尿病心肌病的防治提供新思路。

背景：我课题组前期研究发现促红细胞生成素(EPO)对糖尿病大鼠心功能有保护作用，本研究拟进一步发现其保护作用的分子机制。已有文献表明，高糖状态下，内质网应激增强，SERCA2a蛋白表达减弱，而促红细胞生成素有抗内质网应激从而达到组织器官保护作用，本研究拟证明EPO可以通过减轻内质网应激的途径保护糖尿病大鼠心功能。.主要研究内容：雄性SD大鼠40只，随机分为正常对照组、正常+EPO干预组、糖尿病组、糖尿病+EPO干预组，均n=10。采用链脲佐菌素腹腔注射建立糖尿病动物模型，建模成功后，正常+EPO干预组和糖尿病+EPO干预组大鼠给予皮下注射EPO 1000IU•Kg-1，正常对照组和糖尿病组皮下注射等量的生理盐水，每周一次，共12周。建模前及末次给药后7天，尾静脉采血，检测血糖、血脂和血常规，超声心动图检测心功能，RT-PCR法分析内质网应激蛋白（GRP78）、肌浆网Ca2+-ATP酶（SERCA2a）和EPO受体（EPOR） mRNA表达水平，Western blot技术检测GRP78、SERCA2a和EPOR蛋白表达,免疫组织化学技术检测EPOR蛋白表达。TUNEL检测法检测心肌组织中的凋亡心肌细胞。分离新生SD 大鼠心肌细胞， 培养72 h 后用高糖诱导心肌细胞凋亡，将实验分成五组即正常糖（NG） 组、EPO + NG 组、高糖（HG） 组、EPO + HG 组和ERS 抑制剂4-苯基丁酸（PBA） + HG 组， 流式细胞仪测各组凋亡率， 激光共聚焦显微镜检测各组钙离子的平均荧光强度， Real- time PCR 和Western blot 分别检测各组促红素受体（EPOR）、ERS 标志物GRP78、钙内流蛋白Serca2a 的mRNA 和蛋白表达。.重要结果：糖尿病大鼠心肌组织GRP78表达增加，而SERCA2a和EPOR表达减少。EPO可以减少内质网应激蛋白GRP78的表达，上调SERCA2a和EPOR的表达，改善糖尿病大鼠心功能。同时，EPO可以减少高糖诱导的新生SD大鼠心肌细胞凋亡。.科学意义：本课题组首次发现EPO能抑制内质网应激，增加SERCA2a蛋白表达，从而达到改善高糖诱导的糖尿病大鼠心功能损害的作用。