MAPK信号通路与神经型尼古丁受体在慢性氟中毒脑损伤发生机制中的作用

The aim of the study is to investigate the changes of MAPK pathway and neuronal nicotinic acetycholine receptors in rats with chronic fluorosis of drinking-water type and the neuroblastoma SH-SY5Y cells treated with fluoride in vitro, and further reveal the role of MAPK pathway and nAChRs in the mechanism of brain injury caused by chronic fluorosis. We applied the advanced technologies, e.g, pathology, biological chemistry and molecular biology to detect these items in the study. The ability of learning and memory of rats was measured by behavioral test; the changes of neuropathology by HE staining were observed under microscopy. The distribution of MAPK kinas in brains was detected by immunohistochemistry. The expressions of MAPK at protein and mRNA levels were measured by Western-blotting and Real-time PCR, respectively, The apoptotic death rate in rat brain and SH-SY5Y cells was detected by Flow Cytometry to investigate regulation mechanism of MAPK pathway in cell exposed to fluoride. The study try to reveal the role of MAPK pathway and nAChRs in brain injury caused by fluorosis, which maybe the important procedure for pathogenesis of brain damage of rats with chronic fluorosis. The results of the study may provided important theoretical foundation for clinical care.

本实验采用病理学、生物化学和分子生物学方法在饮水型慢性氟中毒动物模型和体外经氟处理的培养细胞中，研究氟暴露条件下神经型尼古丁受体及MAPK信号转导通路的改变，探讨其在慢性氟中毒性脑损伤发生机制中的作用及其相互关系。行为学实验检测慢性氟中毒对大鼠学习记忆能力影响；形态学检查方法观察慢性氟中毒大鼠脑组织神经病理学改变、MAPK信号通路主要激酶和转录因子脑组织的表达定位；用分子生物学技术检测大鼠脑组织和体外培养细胞中神经型尼古丁受体及MAPK信号通路激酶蛋白和基因水平表达及信号通路作用；用流式细胞技术检测大鼠脑组织和体外培养细胞凋亡率，探讨信号通路在氟暴露条件下的调控机制。本研究力图发现氟对胆碱能神经递质受体和MAPK信号转导系统影响的依据，其可能为慢性氟中毒神经损害发病机制中重要的中间环节,为慢性氟中毒病人临床治疗提供理论依据。

地方性氟中毒是由于过量摄入氟元素导致的全身性损害疾病。在过去的数百年间一直在世界多个国家和地区流行。地方性氟中毒病区在我国多个省份存在，受害人群也仍有一定数量，特别是贵州省一些偏远地区，该病的防治仍有待加强，已罹患氟中毒的人群仍急需有效的治疗方法缓解病痛。对地氟病其他脏器的损害并无明确的缓解方法，神经系统损害表现的头痛、头晕和骨损害早期患者的骨痛、关节痛，始终困扰患者，但临床无明确的诊断标准，也无法采取有效的干预措施。所以从地方性氟中毒发生机制入手，探索其损害发生的过程，寻找干预实施的途径具有重要意义。本课题设计即在此指导思想引导下，立足于地方性氟中毒对神经系统慢性损害的发生机制，为进一步探索干预措施提供理论基础。. 本课题的主要研究内容为MAPK信号系统在慢性氟中毒神经损害发生机制中的作用及其与神经型尼古丁受体关系，包括ERK1/2 、JNK 、P38和 ERK5信号通路的作用交叉对话，神经型尼古丁受体α3、α7对ERK1/2 、JNK 、P38和 ERK5信号通路的调控，MAPK1基因及ERK2激酶编码基因单核苷酸片段多态性与贵州氟病区患者症状的关系。研究结果显示，ERK1/2信号激酶对氟刺激较为敏感，在染氟早期即表现升高趋势，在染氟动物脑组织中表达也明显升高，其表达改变与染氟大鼠学习记忆功能减退存在相关关系，进一步观察其调控神经细胞功能的作用主要表现在维持细胞存活，与PI3K/AKT通路存在协同作用，不受神经型尼古丁受体α3调控；JNK 、P38在氟暴露条件下也出现活性增强，促进细胞凋亡、上调凋亡相关即刻早基因C-fos、C-jun表达，受神经型尼古丁受体α3调控；ERK5信号通路在染氟大鼠脑组织和氟处理培养细胞中表达均升高，与染氟大鼠学习记忆功能减退存在相关关系；MAPK1基因多态位点rs743409与病区女性患者症状差异关系密切和rs7286558多态性与患者骨痛存在关系密切关系。研究结果中ERK1/2信号通路表达与活性对氟暴露的敏感改变，一定程度提示了该通路在氟性脑损害当中的作用。而MAPK1基因的多态位点与病区人群氟中毒症状存在联系，进一步印证ERK1/2通路在氟损害中可能为重要的一个环节。通过对MAPK 信号系统特别是ERK1/2信号通路在地方性氟中脑损害中作用的研究有利于进一步探索缓解氟中毒患者神经系统症状的有效措施。