胰腺癌耐药相关miRNA筛查及调控机制的研究

化疗耐药是导致胰腺癌预后差的主要原因之一，根据肿瘤干细胞理论，我们推测miRNA对胰腺癌干细胞和EMT异常调控可能是导致胰腺癌化疗耐药的重要因素，因此本课题将miRNA－化疗耐药－肿瘤干细胞－EMT联系起来进行研究，为探索胰腺癌化疗耐药机制提供新的思路。本实验通过对不同化疗药物耐药的胰腺癌细胞株miRNA表达谱进行检测，寻找化疗耐药中起关键作用的miRNA，探讨其对胰腺癌干细胞和EMT的调控机制，明确miRNA的核心调控作用；预测并验证miRNA作用的靶基因，进一步分析调控耐药的信号通路和主要分子；通过动物实验探索miRNA的潜在治疗价值，并对手术切除后化疗患者的标本进行检测，验证特定miRNA作为临床预测胰腺癌化疗敏感性指标的价值。经检索国内外未见同类报道。

目的：筛选并验证胰腺癌多药耐药相关的关键miRNA，并对其功能及调控机制进行探索。 方法：通过芯片技术对耐药胰腺癌细胞株SW1990/GEM、SW1990/5-Fu、SW1900/ADM及亲本株SW1990的miRNA表达谱进行筛选，并进行验证，寻找在化疗多药耐药中起关键作用的miRNA；体外上调或下调miRNA，CCK8法检测细胞增殖及耐药表型变化、PI单染检测细胞周期、PI-AnnexinV双染检测细胞凋亡、transwell法检测侵袭及转移能力，Western blot检测靶基因及主要信号通路分子表达水平。生物信息学数据库预测、双荧光素报告基因实验验证miRNA靶基因。 结果：通过基因芯片分析发现，与亲本株相比，耐药株SW1990/GEM中有58条miRNAs表达具有显著性差异；在三株耐药株中同时呈现显著差异的miRNAs有7条。通过qRT-PCT验证发现，miR-497在三株耐药株表达水平均显著低于亲本株。通过miR-497mimics转染SW1990、MiaPaca-2、BXPC-3三株细胞，可以抑制细胞增殖、增加吉西他滨的化疗敏感性、增加细胞凋亡率、抑制细胞侵袭和转移、并使S期细胞减少。转染mimics后，IGF1R，p-AKT， Kras、的表达水平显著降低；转染miR-497 inhibitor后，结果与之相反。结论：miR-497通过调控IGF1R/AKT及RAS信号通路，在胰腺癌多药耐药形成中发挥关键作用。miR-497可能成为新的、逆转胰腺癌耐药的分子靶点。