樟树花粉蛋白质的分离纯化及其致敏动物模型的建立

植物花粉所含的特异性蛋白质成为人体发生过敏性鼻炎和哮喘等疾病的重要变应原。大量的文献报道了国内外多种气传致敏花粉的种类、分布、变应原、致敏性及其治疗等研究结果。目前，国内外已对梧桐、豚草、葎草、梯牧草、蒿属、柏树等10余种花粉的变应原进行了分离纯化和鉴定。然而，关于樟树花粉的蛋白质谱分析、变应原蛋白质鉴定及其致敏机制的研究却鲜有报道。.本项目旨在对樟树花粉的蛋白质谱进行分析鉴定；并对其变应原进行分离纯化、性质鉴定；用克隆重组的变应原建立致敏动物模型，以便对樟树花粉的致敏机制进行深入探索。期望通过调查研究，鉴定出樟树花粉的重要变应原，初步阐明樟树花粉的致敏机制，为今后实施樟树花粉特异性致敏疾病的检测和相应的特异性免疫治疗打下坚实的基础。

本项目围绕和尝试解决樟树花粉是否是上海地区的花粉过敏原以及寻找相应的变应原展开，严格按照课题计划任务书的预定目标执行和既定方案实施。本项目执行一切进展顺利，完成了任务书中的全部内容，主要包括：首先通过反复探索获得了一整套成熟的樟树花粉蛋白质提取和鉴定流程；通过大量血清杂交初步获得了两个花粉变应原；成功建立了樟树花粉致变应性鼻炎小鼠模型；通过生物信息学分析获得了2个已知序列的变应原。已经完成了预期3个目标，解决了3个关键科学问题，完成了10个主要研究内容。目前与本项目相关的已经发表/投稿期刊和会议论文4篇，保证了本项目的顺利结题。主要研究成果如下：.1.建立了一套成熟的樟树花粉蛋白质提取和鉴定流程。樟树花朵小而密、花期短、散粉快，需要在短时间内大量收集和纯化。且植物花粉的蛋白质抽提一直是科研工作者的难点。我们对樟树花粉的采集、纯化、破壁、蛋白质提取、浓缩鉴定等进行反复探索和优化，建立了一套抽提和鉴定流程。.2.在樟树花粉中检测到两个变应原。将上海市西南部春季和秋季气传花粉的调查数据与西南部医院呼吸科中过敏性鼻炎和哮喘病人比例进行曲线拟合分析，提示在上海市西南部,樟树花粉在空气中的大量传播与此时过敏性疾病患者如鼻炎和哮喘的增多相关。通过花粉蛋白质与过敏性鼻炎和哮喘患者血清的点杂交进行筛选，在182份血清中共检测到6份样品出现阳性斑点反应，比例约为3.3%。进一步的Western Blot检测表明引起过敏的变应原可能是花粉中两个约58KD和62KD的蛋白质。.3.樟树花粉致过敏性鼻炎小鼠模型的建立。提取樟树花粉蛋白质，对小鼠进行腹腔和皮下多点注射免疫，并滴鼻激发。致敏组小鼠出现了频繁抓鼻、打喷嚏等过敏性鼻炎症状（评分>5分）；鼻分泌物涂片中嗜酸性粒细胞明显增多，鼻部组织切片显示鼻腔粘膜层明显充血水肿，白细胞浸润；血清中IgE含量明显上升（P<0.05）。成功建立了樟树花粉致过敏性鼻炎小鼠动物模型，樟树花粉会引起部分小鼠个体发生过敏性鼻炎症状。.4.应用生物信息学方法预测樟树花粉的变应原，获得了包括profilin-like protein和Fe-SOD为主的变应原。对比分析这2个基因在植物花粉进化过程中的产生、结构、表达和变异信息，并在进化上和其它物种比较，解释其作为樟树花粉过敏源的可能性，为进一步免疫学分析提供依据。