低致敏性葎草花粉变应原的实验研究

特异性免疫治疗(SIT)是唯一针对I型变态反应疾病病因的治疗方法，但因其有诱导IgE介导的过敏反应的危险，临床应用受到限制。葎草花粉是我国北方地区重要的气传致敏花粉。申请者在前期研究中发现一个葎草花粉主要变应原基因，是一个编码87个氨基酸的钙结合蛋白类Polcalcin变应原，其与钙离子的结合，是诱导变态反应发生的关键。本研究拟在此基础上，应用基因工程的方法改变葎草花粉Polcalcin变应原钙结合能力，降低其IgE结合能力，保留T细胞表位，重组表达低致敏性变异体，分析其二级结构，体外应用免疫学方法、流式细胞仪等检测重组蛋白的IgE结合能力及靶细胞活化能力，筛选低致敏性变应原，细胞水平应用3H-TdR渗入法检测其刺激T细胞增殖能力，在体通过免疫动物检测其抗体产生效果并免疫治疗葎草花粉致敏哮喘动物模型检测其免疫学特性，为低致敏性葎草花粉变应原疫苗应用于SIT，提高SIT的疗效及安全性提供依据

由IgE介导的I型变态反应病是影响全球健康的主要问题之一。特异性免疫治疗是目前唯一针对I型变态反应疾病病因的治疗方法，但因其有诱导IgE介导的过敏反应的危险，其临床应用受到限制。本研究通过基因工程的方法对变应原中的序列和结构进行一定的修饰，保留其T细胞表位，去除或减少其IgE结合能力，从而达到减少致敏性同时保持免疫活性的目的，减少了临床应用时的负面效应。 在这种情况下，高剂量的重组变应原就可以在临床治疗中加以应用，最终可以提高变应原的SIT的有效性及安全性.我们课题组前期研究发现了一个葎草花粉主要变应原基因，是一个编码87个氨基酸的钙结合蛋白类Polcalcin变应原，本研究在此基础上作了如下工作：.重要结果：（1）本研究应用RACE技术合成低致敏性Polcalcin基因；（2）目的基因Pol 1双酶切与PET44a载体的连接构建表达载体PET44a- Pol 1；（3）PET44a- Pol 1重组子转化入表达菌株Rosetta并诱导基因表达，采用AKTA FPLC纯化重组的Pol 1蛋白；（4）体外实验：免疫印迹实验证实重组变应原可与11份血清发生抗原抗体反应，提示该重组变应原具有抗原性。重组葎草花粉变应原与DC细胞、CD4+CD25- T细胞共培养后，重组表达的葎草花粉变应原干预组Foxp3+Treg细胞的百分比较对照组明显增加，说明重组变应原可抑制抗原诱导的Th2细胞分化而强化Th1细胞活性；（5）使用重组变应原疫苗免疫正常小鼠后，重组葎草花粉主要变应原免疫组与粗提葎草花粉变应原免疫组相比，小鼠血清sIgG抗体升高，而sIgE抗体水平下降，以上结果表明重组葎草花粉主要变应原主要诱导产生血清sIgG抗体，具有较好的免疫原性；（6）重组葎草花粉主要变应原免疫治疗哮喘小鼠模型后，与未经免疫治疗的哮喘模型组小鼠比较，有以下不同：⑴小鼠血清sIgG抗体水平升高，sIgE抗体水平降低；（2）小鼠支气管肺泡灌洗液（BALF）中细胞总数及嗜酸性粒细胞比值明显降低；（3）小鼠BALF和脾组织匀浆中的IL-4水平均降低，而IFN-γ水平均升高；（4）小鼠肺部炎症细胞浸润显著减少，炎症程度明显降低。.本研究成功构建了重组变应原疫苗，体外及在体实验证明重组变应原疫苗具有较低的变应原性及较强的免疫原性，能够抑制Th2倾向的免疫反应，并诱导Th1倾向的免疫反应，对哮喘模型具有较好