BMP2和NGF双基因转染骨髓基质干细胞移植治疗骨折的实验研究

骨折愈合是在多种骨生长因子相互作用下实现的，骨形态发生蛋白2(BMP2)、神经生长因子(NGF)是骨折愈合中两个重要生长因子。BMP2诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化，致软骨、骨形成的作用。NGF促进成骨细胞有丝分裂，与骨折愈合密切相关。两者联合应用在生物学功能上形成协同效应。局部应用外源性或内源性骨生长因子构建组织工程骨穿透力较差，生物半衰期短，易失去活性，生物利用率低，需反复使用且剂量大，费用昂贵。基因转染或基因重组可获得大量优质低廉的骨生长因子，同时表达BMP2和NGF双基因真核质粒构建以及联合上述双基因转染骨髓基质干细胞(BMSCs)治疗骨折的研究未见报道。本课题将携带有BMP2和NFG双基因的真核质粒转染BMSCs内，观察双基因在细胞中表达情况。并将转染后的BMSCs移植进入小鼠骨折模型体内，观察上述两种基因联合治疗骨折的效果，解释其治疗骨折的机制。为多基因转染治疗骨折提供依据。

骨折愈合是多种生长因子相互作用下实现的，骨形态发生蛋白2(BMP2)、神经生长因子(NGF)是骨愈合中两个重要生长因子。BMP2诱导间充质细胞迁徙、增殖、分化，致软骨、骨形成。NGF促进成骨细胞有丝分裂，与骨愈合密切相关。两者联合应用在生物学功能上形成协同效应。局部应用外源性或内源性骨生长因子构建组织工程骨穿透力差，生物半衰期短，易失去活性，生物利用率低，需反复使用且剂量大，费用昂贵。基因转染或基因重组可获得大量优质低廉的骨生长因子，同时表达BMP2和NGF双基因真核质粒构建以及联合上述双基因转染骨髓基质干细胞(BMSCs)治疗骨折的研究未见报道。本课题采用全骨髓贴壁法培养 BMSCs ，培养后的第5代细胞行流式细胞仪表型检测，结果第5代大鼠BMSCs高表达CD29，CD90，而不表达CD31，CD45。说明本实验培养获得的细胞符合大鼠BMSCs的表型特征。大鼠 BMSCs 成骨、成脂分化能力的鉴定。成骨分化鉴定: P5代细胞用成骨诱导液培养后进行茜素红染色，可见染色成红色的钙结节。成脂分化鉴定: P5代细胞用成脂诱导液培养后进行油红O染色，可见染成红色的脂肪滴。BMSCs 培养稳定传代后进BMP2-NGF双基因重组真核质粒进行转染，转染介质为 Lipofectamine2000脂质体。转染后Western-blot、I型胶原免疫组化染色、ALP试剂盒检测、茜苏红染色钙结节及统计学分析均提示双基因转染组的目的蛋白表达量、I型胶原蛋白表达量、ALP表达量、钙结节形成数目均高于单基因转染组、空质粒组及阴性对照组。此阶段实验说明了双基因转染大鼠 BMSCs 可以成功在细胞内进行目的基因的表达，且实验组蛋白表达量均高于其他单基因组和阴性对照组。表明双基因转染 BMSCs 的可行性及协同作用。NGF与BMP2双基因修饰大鼠 BMSCs ，其成骨能力均优于单基因修饰，细胞能够持续稳定的释放BMP2及NGF基因。动物实验也表明BMP2和NFG双基因转染BMSCs移植进入小鼠骨折模型体内后，不仅能存活，而且能加速了骨诱导、骨形成过程，使骨折愈合的速度加快。两者在生物学功能上形成协同效应，成骨效应优于单独应用一种生长因子。本课题还探讨了不同时间生理载荷影响成骨细胞生物学特性的机制。为将来基因转染 BMSCs 治疗骨折在力学方面打下基础。综上所述，本课题为多基因转染治疗骨折提供了依据。