基于嗜神经病毒特异顺行及逆行跨单突触全新神经回路示踪系统的研究

Understanding structure and function of neural circuit is the central question of neuroscience. "Science Watch" of this year selected Connectome project as the top 6 important projects in the coming years. Neurotropic virus such as Rabies virus and Pseudorabies virus have been extensively and successfully engineered to explore neural circuit. However, lots of work still need to be done to improve the neuotropic specificity and safety of these neural circuit path finders. More importantly, there is, so far, no good mono-transsynaptic tracer which can label the neural circuit in a specific anterograde manner. Due to the lack of multidisciplinary research between neuroscience and virology, the research on neural circuit in China is far behind the advanced world level. By combining the strength of neurotropic virus research in State Key Laboratory of Agricultural Microbiology with my excellent training in neural circuit research, I am planning to: (1)develop the first transsynaptic antrograde tracer with stringent neurotropic specificity to map the output of neural information;(2) develop a novel safe, low toxic and monotranssynaptic tracer based on Pseudorabies virus; (3) fuse the main toxic virus proteins with destable domain to reduce toxicity of the circuit tracers; (4) insert or update the reporter proteins such as, GcamP6,voltage sensor, AlstR and optogenetics tools in the tracer viral genome so that we can monitor or manipulate neuronal activity in specific circuit. This will pave the way to systematically investigate the structure and function of neural circuit by combining live animal imaging, behavior assay and optogenetics.

神经回路的结构和功能是神经科学核心问题。神经回路的解析依赖于回路示踪工具。嗜神经病毒作为示踪工具广泛运用于神经回路研究。但其毒性、跨突触特性、嗜神经性和安全性方面存在缺陷，且没有一套严谨的跨单突触顺行示踪系统。由于病毒和神经交叉学科研究薄弱，嗜神经病毒示踪系统研究进展缓慢，制约了神经科学研究。本课题结合农业微生物国家重点实验室在狂犬和伪狂犬病毒雄厚的研究基础和申请人神经科学的优良训练，针对当前示踪系统缺陷，利用病毒反向遗传操作等方法，1)创建全新基于伪狂犬病毒,安全、低毒、跨单突触示踪系统; 2)开发全新跨突触顺行(Anterograde)示踪系统,以探索神经信息输出; 3)利用可调控降解元件降低病毒毒性; 4)插入或升级GcamP6、电压敏感蛋白和光遗传学工具到狂犬和伪狂犬病毒基因组以检测操控特定神经回路功能。为在神经回路水平上整合光遗传学、活体成像、行为学实验的系统研究打下坚实基础。

本研究首先利用CRISPR/Cas9和Cre/lox基因编辑系统开发了一套快速制备伪狂犬病毒多基因缺失株的新方法。我们利用该方法对其伪狂犬病毒进行基因组操作，将伪狂犬病毒TK、gE等毒性及跨突触基因敲出，并将多种荧光蛋白和带有不同亚细胞定位的荧光蛋白插入伪狂犬病毒基因组中，以用于神经环路示踪。此外，我们还利用Tet-on和Destabilizing Domain两套体系同时严格控制TK基因表达，开发出一套全新安全性高，毒性低的，基于伪狂犬病毒的可调控跨突触示踪工具。此外我们还利用这套系统控制狂犬病毒G蛋白基因的表达和稳定以降低毒性。同时我们还揭示了狂犬病毒的先导RNA参与狂犬病毒的毒力调节。我们克隆了不同狂犬病毒株G蛋白基因，并利用狂犬病毒的反向遗传系统将最新的光遗传工具蛋白基因、钙成像工具蛋白基因升级克隆于基于狂犬病毒基因组中，并用于神经回路的示踪以及神经环路活动的监测和调控。在研究过程中，我们发现不同的不同的嗜神经病毒对于神经元的嗜性和毒性是存在差异的，因而必然会造成神经环路示踪的差异，进而影响后续研究。由于该项研究内容与本项目内容密切相关，我们也比较了不同嗜神经病毒的毒性和嗜性的差异。目前与本研究相关且第一标注的SCI论文发表3篇，相关专利申请一项，另有一篇与本基金研究直接相关高水平论文正在整理撰写中。