绵羊卵巢颗粒细胞periostin基因的表达调控及功能研究

Periostin may be associated with key factors related to ovulation. However, few previous researches have indicated the periostin expression in sheep ovarian follicles regulation and molecular mechanism. Previous studies have found that the difference still exists between large and small follicle, on the perspectives of GCs in mRNA and protein expression levels. In addition, the peaks of mRNA abundance appear at 8 and 24 hours after hCG treatment. The intending project mainly aims at: (1) Discovering the molecular mechanism of hCG induced periostin, which is based on the analysis of its promoter region, combining with EMSA or ChIP and siRNA, studying its transcriptional regulation mechanism further; (2) Constructing the Luciferase report, verifying whether periostin miR-200c target genes of miR-200c, testing the effects of miR-200c on cell proliferation; (3) Building slow virus expression vector and siRNA, analyzing its impact on cell vitality, apoptosis and the trend of key genes expression in steroid synthesis. Via this study, the molecular mechanism of the participation of periostin can be expounded, the mechanism of follicle development, maturation and ovulation will be also revealed, the results can be used both theoretically and experimentally.

Periostin基因可能与排卵相关的关键因素有关，而关于其在绵羊卵泡中的表达调控和分子机制等方面的研究，尚未见报道。前期研究发现，periostin在大、小卵泡GCs中的mRNA和蛋白水平都存在差异；另外，其mRNA丰度分别在hCG处理后8 h 和24 h 出现峰值。本项目旨在：（1）研究 hCG 诱导periostin表达的分子机理，并在此基础上对其启动子区进行分析，结合EMSA或ChIP以及siRNA技术，进一步研究其转录调节机制；(2) 构建荧光素酶报告载体，验证 periostin 是否是miR-200c的靶基因并检测 miR-200c 对细胞增殖的影响；(3) 构建慢病毒过表达载体和siRNA，分析其对GCs活力、凋亡的影响及类固醇合成关键基因表达趋势。通过本研究，进一步阐明 periostin 参与调控卵泡发育的分子机理，为揭示卵泡周期和排卵的分子调控机制提供理论和试验依据。

POSTN是一种基质细胞蛋白，可以促进细胞粘附、迁移、增殖、分化和存活等非结构性细胞活动，但其在绵羊卵泡中的作用却不明确。本项目以绵羊卵泡颗粒细胞（GC）为试验材料，探讨了POSTN基因在卵泡中的表达规律，分析了生殖激素FSH和LH对POSTN基因下游信号通路以及细胞增殖和凋亡的影响，研究了POSTN基因启动子可能的转录因子，并验证了POSTN基因与oar-miR-200c的靶向关系。结果如下：（1）从绵羊卵巢组织中克隆出POSTN基因 cDNA序列，POSTN在绵羊各组织中均有表达，在卵巢组织中表达量较高；随着卵泡直径增加，POSTN表达量逐渐升高，且在卵泡GC中呈现高表达；细胞免疫荧光显示POSTN 在细胞核和细胞质中都有分布；（2）添加FSH，能显著增加培养GC中POSTN的表达，并加速细胞增殖，减少其凋亡，有效促进增殖相关基因PCNA、Ccnd-2和抗凋亡相关基因Bcl-2的表达；干扰POSTN后，抑制细胞增殖，促进了凋亡，同时上调了凋亡相关基因Bim、FasL和Caspase-3的表达；（3）位于POSTN上游-222至-210的SRF结合位点突变明显降低了POSTN转录活性；FSH处理24 h后，能促进SRF表达，实现POSTN转录增强，该结果与ChIP分析结果相一致；（4）双荧光素酶结果显示，oar-miR-200c通过与POSTN基因 3'UTR区直接结合来影响其基因表达；细胞转染oar-miR-200c后，显著降低POSTN基因和蛋白的表达量；（5）添加5 IU LH作用4 h是促进POSTN表达的最佳条件，干扰POSTN基因后，添加LH能挽救POSTN基因的表达；过表达POSTN显著促进细胞增殖，并能显著促进FAK表达和磷酸化，LH与POSTN协同作用以增加粘着斑途径的活化；干扰POSTN显著降低FAK表达和磷酸化，LH与POSTN协同减弱粘着斑途径的活化。