基于线粒体蛋白质组学的氟中毒小鼠心肌功能损伤的分子机制研究

Abstract: It is mentioned in the General Office of the State Council's Notice of the national endemic disease prevention of The Twelfth Five-Year Plan that, Long-term control mechanism would be established only if the pathogenesis of fluorosis is clear. However, the mechanism of the damage in Soft tissue, especially in cardiovascular system due to fluorosis has not been clarified. Large amount of epidemiological investigation and animal experiments have shown that, the concentration of fluorine in drinking water has a huge impact on the occurrence of cardiovascular disease. According to the previous study in our research group, fluorine is able to induce cardiomyocyte in vitro to produce superfluous ROS, which leads to the damage of mitochondria and apoptosis of cardiomyocyte. And it can be deduced that the link between myocardial injury induced by fluorine and the occurrence of oxidative stress in mitochondria does exist, and the change of some functional proteins may be responsible for the whole process of myocardial injury. So, different model of varying fluorine's concentration in fluorosis mice will be established in our project. The mitochondria of high purity will be extracted by the method of differential centrifugation, besides, the methods of dimensional electrophoresis, mass spectrometry and bioinformatics are also used to establish the varying proteome expression profiles of fluorosis mitochondria, so that the target spot of protein will be screened according to the different degrees of fluorosis. By combining Myocardial Ultrastructure Analysis and the physiological parameter of myocardial contraction function, and by synthetic discussion of the mechanism based on the damage of myocardium due to fluorine, the powerful theoretical basis of the prevention and cure of cardiovascular disease due to fluorine will be provided.

国务院办公厅关于《全国地方病防治"十二五"规划的通知》指出：只有明确地氟病的发病机理，才能建立长效防治机制。目前氟对非骨相组织尤其是心血管系统的损伤机理还未阐明。大量的流行病学调查以及动物实验方面都显示饮水中氟的浓度与心血管疾病的发生有很大关系。本课题组前期研究表明氟可以诱导体外培养心肌细胞产生过量的ROS，导致细胞线粒体受损，细胞出现不同程度凋亡或坏死。由此推断氟诱导心肌细胞凋亡与细胞线粒体中氧化应激的发生有明显关系，同时某些功能蛋白质的改变可能参与了整个心肌损伤过程。因此，本项目将建立不同浓度小鼠氟中毒模型，通过差速离心的方法得到高纯度的线粒体，结合双向电泳、质谱分析、生物信息学的方法构建氟中毒心肌线粒体差异蛋白质组表达谱，筛选出氟中毒的差异表达蛋白质靶点，结合心肌超微结构分析和心肌收缩功能的生理参数，进一步探讨氟对心肌损伤的毒性机制，为防治氟中毒心血管疾病提供有力的理论依据。

目前氟对\心血管系统的损伤机理还未阐明。大量的流行病学调查以及动物实验方面都显示饮水中氟的浓度与心血管疾病的发生有很大关系。因此，本项目在实验室模拟环境中氟污染的实际，建立不同浓度大鼠慢性氟中毒模型，进行了如下研究： 1）氟中毒大鼠心肌组织形态学与超微结构的改变，随着饲喂氟化钠浓度的增加，实验组大鼠心肌组织的病理损伤逐渐加重。组织切片出现心肌细胞变形，心肌间出血以及组织断裂等现象；慢性氟中毒导致心肌组织细胞线粒体数目和体积明显增多，嵴疏松模糊；高浓度下肌纤维断裂严重，排列严重紊乱，多数线粒体结构破裂，Z线和M线断裂，闰盘连接彻底断裂。2）氟对大鼠心肌收缩功能的影响，利用血压容积环（PV-loop）监测染氟一段时期的大鼠心脏收缩与舒张能力的相关参数，随着染氟浓度的增加，高氟组心率明显下降；其它各实验组的心输出血量和心脏射血分数较对照组均有不同程度的降低，心肌组织收缩能力明显的降低。3）氟对大鼠心肌氧化应激的影响，随着染氟浓度的增加，心肌组织中抗氧化酶SOD、CAT、GSH-Px活力降低，而脂质过氧化产物MDA含量升高。氟大量蓄积引起脂质过氧化作用增强，抗氧化酶活力受到抑制；同时，破坏了线粒体和细胞膜通透性，导致琥珀酸脱氢酶和ATP酶活性下降。4）氟对大鼠心肌差异蛋白表达的影响，主要使用iTRAQ技术进行蛋白质相对定量。在本次质谱实验中共鉴定到1607个蛋白，5777个肽段，其中含5388个Unique 肽段 。 当蛋白丰度差异倍数达到1.2倍以上，且经统计检验其p-value值小于0.05时，视为差异蛋白。分别比较对照组和低氟组、中氟组、高氟组的差异情况。分别定义了173、118和129个差异蛋白。. 综上，氟对大鼠心肌系统的影响，不仅表现在组织形态学和心肌收缩功能下降等方面，同时还会引起心肌氧化应激产生，氟大量蓄积引起脂质过氧化作用增强，抗氧化酶活力受到抑制，破坏了线粒体的结构和细胞膜通透性。最终引起相关的蛋白表达差异，具体的差异蛋白验证实验还在进行中，我们将综合差异蛋白的生物学功能与氟中毒的关系，来揭示差异蛋白在环境氟中毒中对心肌功能损伤的作用。. 本项目到目前为止共发表相关期刊论文8篇，其中SCI收录6篇，北大核心刊物2篇；参编著作1部；项目组成员共参加国际会议3人