纤维结合素对椎间盘基质代谢和退变的影响及其分子机制研究

Intervertebral disc degeneration is one of the major causes of low back pain. Fibronectin (Fn), a multifunctional glycoprotein found in the normal and degenerative cartilages and intervertebral discs, could induce degeneration by suppressing matrix synthesis and upregulating matrix degradation. The results of our previous study demonstrated that fibronectin fragment (Fn-f) could induce the decrease of matrix metabolism and disc degeneration. The mechanism is still unknown. Most of the previous studies concerning the molecular mechanism of Fn were in cartilage, which is with similar cellular and extracellular components with intervertebral disc. What is the molecular mechanism of Fn-induced disc degeneration? The current study was designed to recognize the effect and mechanism of Fn on the metabolism of matrix in disc. N-terminal 30 kDa Fn-f with different concentration was applied to the nucleus pulposus cells in vivo and in vitro. Cell proliferation and apoptosis, synthesis of proteoglycan and collangen type II, as well as level of factors involved in the IGF-1/PI3K/Akt and MAPK signaling pathways, MMPs, and TIMP-1, were analyzed. Exogenous IGF-1, MAPK inhibitors, and TIMP-1 in vitro, as well as rAAV2-IGF-1 and rAAV2-TIMP-1 genes in vivo, were applied to the Fn-f-treated nucleus pulposus cells to explore further the mechanism of Fn-induced matrix degradation, by the analysis of matrix synthesis, expression of signaling molecules, and changes in histology and radiology of the discs. The current study design can provide a novel therapeutic modality and evidence in basic research for the prevention and treatment of disc degeneration.

椎间盘退变是下腰痛的主要原因之一。纤维结合素Fn是椎间盘和软骨中存在的一类糖蛋白，可以调节基质代谢，导致退变。我们前期研究证实，Fn可致兔椎间盘基质水平下降和退变，但机制不明。既往Fn作用机制的研究多集中在关节软骨方面，椎间盘与软骨具有相似的细胞和细胞外基质构成，那么Fn是通过什么机制影响椎间盘基质代谢的呢？本研究拟将Fn作用于体外和体内的兔髓核细胞，观察细胞存活和基质代谢，以及IGF-1/PI3K/Akt和MAPK信号通路分子、MMPs和TIMP-1的表达，了解Fn影响髓核细胞基质代谢的机制。观察体外应用IGF-1、MAPK抑制物和TIMP-1、体内应用rAAV2-IGF-1和rAAV2-TIMP-1基因转染对Fn诱导椎间盘退变的作用，分析其对于基质代谢通路和MMPs的影响，进一步阐明Fn调节基质代谢的机制。了解椎间盘退变的具体分子机制，可为椎间盘退变的防治提供新的实验依据和理论指导。

腰椎间盘退变是下腰痛的主要原因之一。纤维结合素Fn是软骨和椎间盘中存在的一类糖蛋白。我们前期研究证实，Fn可致兔椎间盘基质水平下降和退变，但机制不明。既往Fn机制研究多集中在软骨，发现不同浓度Fn对软骨基质合成的影响不同，对IGF、MMPs和MAPK通路分子的影响不同。本课题对不同浓度Fn对髓核细胞的作用进行了分子水平研究。我们首先进行了大鼠髓核细胞的体外原代和传代培养，行组织染色和II型胶原的免疫组化和荧光检测，进行髓核细胞鉴定。不同浓度Fn作用于体外培养髓核细胞，发现低浓度Fn对细胞活性无显著影响，500nnol/L Fn可导致细胞活性显著降低，低浓度Fn（≦100nnol/L）对细胞增殖和凋亡无显著影响，高浓度Fn可致细胞增殖和凋亡显著增加。我们检测了不同浓度Fn对髓核细胞基质成分蛋白多糖和II型胶原的mRNA和蛋白表达的影响，发现培养早期1nM的Fn可显著促进蛋白多糖和II型胶原mRNA的表达，但蛋白表达无显著差异，10nM、100nM和500nM的Fn显著降低II型胶原mRNA和蛋白的表达；培养后期低浓度Fn显著提高蛋白多糖和II型胶原表达，高浓度Fn可导致蛋白多糖和II型胶原mRNA和蛋白的表达显著降低。不同浓度Fn对MMPs的mRNA表达均显著升高，TIMP-1mRNA表达均下降，对IGF-1的mRNA表达作用不明显。不同浓度Fn作用下MAPK通路分子JNK和P38表达显著增高，ERK1/2表达降低，IGF-1、MMP3和MMP13表达均显著增高，呈剂量依赖性，高浓度Fn使p-Akt表达显著下降。应用IGF-1、MAPK通路抑制物和TIMP-1可显著降低高浓度Fn对细胞活性和凋亡的影响。IGF-1和TIMP-1与对照组相比，显著改善高浓度Fn对蛋白多糖和II型胶原的降低作用。应用MAPK通路抑制物，导致高浓度Fn作用的髓核细胞中MMP3和MMP13的mRNA和蛋白表达下降，蛋白多糖和II型胶原mRNA和蛋白表达增高。我们的研究证实，不同浓度的Fn对椎间盘细胞作用不同，低浓度Fn可导致基质合成增加，高浓度Fn可降低细胞活性增加凋亡，并通过影响IGF/PI3K/Akt通路和MAPK通路导致下游分子MMP3和MMP13表达增高、细胞基质合成下降进而导致椎间盘退变。我们的发现为Fn参与椎间盘退变提出新的分子机制，为椎间盘退变的防治提供新的思路和基础研究证据。