Lkb1基因功能缺失调控肉用山羊肌内脂肪细胞分化聚脂的分子机制

Intramuscular fat (IMF) deposition is determined by intramuscular adipocyte differentiation and lipid accumulation, and exploration of specific regulator functions in IMF deposition is greatly important for molecular breeding of meat goat. Our previous research found that Lkb1 loss-of-function enhances goat intramuscular adipocyte lipid accumulation, however, the underlying molecular mechanism of this biological process largely remains uncertain. Here, intramuscular fat cell from Jianzhou Big-Eared goat is used as the cell model. Firstly, knockdown of Lkb1 is mediated by RNAi, and then we carried out Bodipy staining, gas chromatography and gene expression assay to analyze the roles of Lkb1 in intramuscular adipocyte adipogenesis. Mechanistically, the potential target proteins and signaling pathways of Lkb1 are screened by proteomic and transcriptomic related techniques. Then, co-immunoprecipitation (CoIP) and protein phosphorylation analysis are performed to reveal bona fide phosphorylation sites of target protein and detect activity of its mediated signaling pathway. Lastly, the target protein-pathway of Lkb1 is interfered using activator or inhibitor to confirm its specific mechanism regulating goat intramuscular fat accumulation. This study will not only deeply elucidate the function and molecular mechanism of Lkb1 regulation on intramuscular adipocyte fat deposition, but also provide the key target for molecular breeding of meat goat.

肌内脂肪细胞分化聚脂决定肌内脂肪的沉积，挖掘肌内脂肪沉积的特异调控因子是肉用山羊分子育种的关键。申请人前期发现：干扰Lkb1基因促进山羊肌内脂肪细胞脂质积聚，但其作用机制尚不清楚。因此，本项目拟以简州大耳羊肌内脂肪细胞为模型，首先利用RNAi介导Lkb1基因功能缺失，然后采用Bodipy染色、高效气相色谱、基因表达分析等技术系统研究Lkb1干扰对肌内脂肪细胞分化聚脂的调控；重点采用蛋白质组学、转录组学等技术筛选Lkb1作用的靶蛋白及信号通路；在此基础上，利用CoIP、蛋白质磷酸化检测技术深入研究Lkb1调控靶蛋白的磷酸化位点及靶蛋白介导信号通路的活性变化；最后以激活剂及抑制剂干预Lkb1作用靶蛋白-信号通路的策略，明确其特异调控肌内脂肪细胞聚脂的分子机制。研究结果不仅能深入阐明Lkb1调控肌内脂肪细胞脂质沉积的作用及分子机理，而且为肉用山羊的分子育种提供重要靶点。

肌内脂肪细胞分化及脂代谢决定肌内脂肪的沉积，挖掘肌内脂肪沉积的特异调控因子是肉用山羊分子育种的关键。前期发现干扰Lkb1基因促进山羊肌内脂肪细胞脂质积聚，但其作用机制尚不清楚。因此，本项目拟以简州大耳羊肌内脂肪细胞为模型，首先利用RNAi和腺病毒技术介导Lkb1基因干扰与过表达，然后采用Bodipy染色、基因表达分析、拟靶向代谢组等技术系统研究Lkb1干扰对肌内脂肪细胞分化、脂代谢及脂类物质组成的调控作用；研究结果显示干扰LKB1基因促进山羊肌内脂肪细胞脂质积累并上调脂肪细胞分化关键转录因子、甘油三酯合成相关基因的表达，而过表达LKB1抑制脂质积累并下调上述基因的表达。进一步气相色谱检测显示山羊肌内脂肪细胞含409种脂类物质，多不饱和脂肪酸种类占比为66%；与对照组相比，干扰山羊肌内脂肪细胞的LKB1上调了72种脂类物质，其中甘油三酯含量最高，其次为脂肪酸含量，特别是多不饱和脂肪酸AA、EPA和DHA的含量显著升高，表明干扰LKB1促进山羊肌内脂肪细胞分化及多不饱和脂肪酸的生成。重点采用RNA-seq技术发现干扰LKB1上调425个差异蛋白编码基因，下调618个；差异蛋白基因主要富集于FAK信号及其下游的PI3K-Akt信号通路，采用FAK信号的特异抑制剂处理干扰LKB1的肌内脂肪细胞，与干扰组相比，处理组恢复了促进成脂的表型，表明干扰LKB1通过FAK信号通路促进山羊肌内脂肪沉积。在此基础上，将转录组与脂代谢组进行关联分析显示差异基因与脂肪酸生成模块关联强度最高，结合功能实验，表明干扰LKB1通过调控HACD4/FABP3/ACSL1的表达促进多不饱和脂肪酸的生成。最后将LKB1基因表达量与肌内脂肪含量及脂肪酸的不饱和度进行关联分析，研究表明LKB1基因与TAG含量和脂肪酸的不饱和度呈负相关。以上研究结果深入阐明Lkb1调控肌内脂肪沉积及多不饱和脂肪酸生成的分子机理，为将LKB1基因作为肉用山羊分子育种的新靶点提供重要依据。