(AABB)n 型α-螺旋短肽的从头设计及抗肿瘤和细胞选择性机理研究

α-helical anticancer peptides (αACPs), which are simple, low toxic and non-resistant by cancer cells, are the ideal candidates of the conventional anticancer drugs. There are still some liminations of the present de novo design principles of the αACPs and it is unclear why some αACPs have anticancer activity and cell selectivity. Here we de novo design serials of the αACPs simplified as (AABB)n(A: hydrophobic amino acid; B: hydrophilic amino acid; n=1-4）based on the amphipathic and cationic properties of natural antibacterial peptides and α-helical protein folding principles. The concent of the cationic and hydrophobic residues within the repeat units could balance the long-range repulsive forces and the short-range hydrophobic interactions. The secondary structures and aggregates of the peptides will be tested by using the CD spectra and AFM. The anticancer mechanism of the peptides will be studied by testing the membrane integrity, cytoskeleton changing and the related gene transcription of cancer cells. We will investigate the cell selectivity of the peptides by changing the hydrophobicity, conformation and helical numbers of the designed peptides. Furthermore, the mode of action of the peptides aganist the model lipid membrane at the molecular level will be explored by using the LB technique and the confocal microscopy. The aim of this proposal is to expand the arsenals of synthetic α-helical anticancer peptides simplified as (AABB)n with high cell selectivity and discover the anticancer mode of action, which would be helpful for the design of new anticancer peptides drugs in the future.

α-螺旋抗肿瘤肽结构简单，毒性小且不易诱使肿瘤细胞产生抗性，是传统抗肿瘤药物的理想替代品，但其从头设计方法还存在一定的局限性，其抗肿瘤、细胞选择性机理研究尚不深入。本项目依据抗菌肽的两亲性阳离子特征及α-螺旋蛋白折叠理论，将疏水/亲水氨基酸交替排列以平衡多肽分子内近距离及远距离作用力，设计模板为(AABB)n(A:疏水氨基酸；B:亲水氨基酸；n=1-4）的α-螺旋肽，拟采用圆二色谱等仪器测定多肽的分子结构及聚集状态；从对肿瘤细胞的膜通透性、细胞骨架及相关基因的影响等方面详细探讨多肽抗肿瘤机制；通过改变多肽的疏水性、空间构象及螺旋个数深入研究其分子结构与细胞选择性之间的关系；以磷脂膜为研究载体，借助LB膜仪等揭示多肽与磷脂在分子水平上的作用机理。本项目旨在提出(AABB)n型高选择性α-螺旋抗肿瘤肽的设计方法并明确该类短肽的抗肿瘤及细胞选择性机理，为多肽类抗肿瘤药物的研发提供实验及理论基础。

近年来研究发现一些α-螺旋抗菌肽具有抗肿瘤活性同时具有较低的细胞毒性，有望成为较好的抗肿瘤药物。本项目跟据天然抗菌肽的两亲性和阳离子性结构特征，结合蛋白质a-螺旋折叠理论，设计了(AABB)n （A：疏水氨基酸；B：亲水氨基酸；n=1-4）的α-螺旋肽，这些设计的多肽除G(IIKK)I-NH2和G(VVKK)3V-NH2外，其他多肽在疏水环境或负电性磷脂囊泡中，均可发生二级结构的转变形成两亲α-螺旋结构。逐渐增加G(IIKK)nI-NH2分子中序列单元的重复次数n（1-4），多肽抗菌抗肿瘤活性以及对正常细胞的毒性都会随之增强。其中G(IIKK)3I-NH2具有高效低毒的特点。.通过研究多肽两亲螺旋结构中亲/疏水面夹角以及亲/疏水面交叉位置不同对多肽活性的影响发现，亲/疏水面完全分离的多肽分子对正常细胞的毒性明显增大，在疏水面插入一个Lys分子后可明显降低多肽对正常细胞的毒性而不影响多肽分子的抗菌抗肿瘤活性；改变疏水氨基酸侧链构型，抗菌肽对正常细胞的毒性明显改变。缩短疏水氨基酸侧链长度，短肽的疏水性明显降低，其生物学活性也明显降低；在一定范围内缩短亲水氨基酸的侧链长度，可以明显提高多肽抗肿瘤活性且增加对正常细胞的毒性；a-螺旋肽的溶血活性与多肽分子的表面活性存在明显的正相关特性，表面活性强的螺旋肽其抗肿瘤活性高，同时其溶血毒性也增强。通过研究G(IIKK)3I-NH2的抗肿瘤机制，我们发现该多肽也像多数天然抗菌肽一样破坏肿瘤细胞的膜结构，快速转移到细胞内部，从而具有与细胞内重要的负电生物大分子发生作用的可能，可通过激活死亡受体信号以及线粒体通路诱导肿瘤细胞发生凋亡。.通过本项目的研究，验证了我们关于a-螺旋肽的(AABB)n设计方法切实可行，同时发现该系列多肽能够通过破坏肿瘤细胞的细胞膜以及诱导肿瘤细胞凋亡等方式杀伤肿瘤细胞；对于小分子α-螺旋肽具有抗肿瘤活性和细胞选择性的关键因素是具有适中的疏水性（15~20 min，HPLC高效液相滞留时间）和表面活性（表面压在10~16mN/m）。另外，多肽在磷脂内的螺旋结构的转变也是多肽具有抗肿瘤活性的重要结构特征。该实验数据为多肽类抗肿瘤药物的研发提供实验及理论基础。以本项目为依托，本人以第一作者发表相关论文8篇，授权专利1项。培养研究生7人。.