弓形虫毒力激酶ROP18磷酸化降解p53介导宿主免疫调控的机制

Rhoptry kinase 18 (ROP18) is one of vital virulence factors of Toxoplasma gondii. However, its key substrates and mechanisms underlying ROP18-mediated toxoplasmosis remain to be clarified. In our primary study, we showed for the first time that p53, a key transcription factor in immune responses, is a novel substrate of ROP18. We found that transfection of ROP18 induced phosphorylation-mediated p53 degradation. In agreement with this result, infection of Toxoplasma tachyzoites also led to p53 degradation in cells. It has been reported that knockout of Gadd45α, which is a downstream target of p53, results in impaired immune responses to Toxoplasma antigen. Base on above findings, we proposed a new hypothesis that during Toxoplasma infection, ROP18 induced p53 degradation by phosphorylation, which leads to decreased Gadd45α expression and thus immune responses suppression. In the proposed study, using the molecular cell biologic and immunologic techniques and transgenic mouse models, we aim to reveal the mechanisms of immunologic regulation via ROP18-mediated p53 degradation, and clarify the signaling involved in ROP18-p53 mediated pathogenesis. The findings of this study may provide novel targets for the treatment of toxoplasmosis.

弓形虫蛋白激酶ROP18是弓形虫致病力决定性的毒力因子之一，但其作用的关键宿主靶蛋白和介导的免疫相关致病机制仍有待阐明。我们首次发现宿主细胞内重要的转录因子p53是弓形虫蛋白激酶ROP18作用的新的宿主靶蛋白：具有激酶活性的ROP18转染细胞表达可磷酸化降解p53，且ROP18对p53的降解作用也为弓形虫速殖子感染实验所证实。另已有研究报道敲除p53下游靶基因Gadd45α可抑制宿主对弓形虫抗原的免疫反应，进而引起急性感染。由此我们提出新的科学假设：弓形虫毒力蛋因子ROP18通过降解p53抑制其下游靶基因Gadd45α表达来调控宿主对弓形虫感染的免疫反应。本项目拟利用分子细胞生物学、免疫学及转基因小鼠感染模型对此进行深入研究，以阐明ROP18磷酸化降解p53介导的宿主免疫调控机制，为确立将p53靶蛋白及其下游免疫信号通路作为致病弓形虫-宿主相互作用的干预新靶点提供科学依据。

弓形虫棒状体分泌激酶ROP18是弓形虫重要的毒力因子之一，在弓形虫的急性感染和隐形感染阶段起着非常重要的作用。虽然酵母双杂交技术能鉴定蛋白-蛋白之间的相互结合作用，但无法鉴定目的蛋白活性对靶蛋白活性的影响。我们通过酵母表达系统表达纯化了具有激酶活性的ROP18蛋白和激酶失活的ROP18蛋白。利用功能蛋白芯片高通量筛选ROP18激酶的潜在宿主靶蛋白，发现了ROP18激酶的68个新的宿主靶蛋白。其中MAPK信号通路的p38及下游蛋白p53均是ROP18激酶的宿主靶蛋白；p53是这68个新宿主靶蛋白互作的中心节点蛋白。通过免疫荧光共定位、免疫共沉淀和pull down实验确证ROP18与p38和p53的互作。体外生化研究结果表明：SB203580抑制p38的磷酸化后，宿主细胞内弓形虫的复制速率显著降低。我们还发现有激酶活性的ROP18质粒转染导致宿主细胞内的p53蛋白降解，然而激酶失活的ROP18质粒转染不会引起p53蛋白降解。且与野生型虫株相比，ROP18激酶过表达的虫株感染显著降解p53蛋白。小鼠感染实验结果表明：p53敲除的C57小鼠易于死于I型弓形虫的急性感染和II型弓形虫的慢性感染。结果首次证明：弓形虫虫株的毒力因子ROP18通过磷酸化MAPK信号通路上的p53使其发生降解，进而促进弓形虫在宿主体内的增殖，这是弓形虫在宿主细胞内赖以生存和快速增殖的机制之一。该研究为筛选弓形虫增殖的新药靶标奠定基础。在本项目的支持下，我们还发现ROP18与Smad1互作，ROP18激酶通过磷酸化Smad1的187位丝氨酸位点将其泛素化，通过蛋白酶体依赖的途径将Smad1蛋白降解，以及发现与ROP18相关的另外一种旋毛虫蛋白TsCPB2。已发表研究论文3篇（SCI收录2篇，核心1篇），申请专利1篇。