咖啡种质资源遗传多样性研究及遗传连锁图谱构建

咖啡是我国热区主要经济作物之一，目前对其种质资源的遗传特性了解较浅，而且缺乏可利用的遗传图谱，致使其性状的遗传规律、基因组的进化研究受到了很大限制，新品种选育速度缓慢。因此，有待加快咖啡种质资源遗传特性研究的步伐，构建高密度的咖啡分子遗传图谱。.本研究拟利用CTAB和SDS两种方法提取DNA，根据比较DNA的质量和浓度，改良提取方法，探索最适提取方案；通过U25(55)均匀设计对RAPD、SSR和ISSR-PCR分子标记体系中模板DNA、dNTPs、Taq DNA聚合酶、Mg2+、引物5个组分的浓度进行优化，建立最适PCR反应体系；利用优化体系分析我国收集保存的咖啡种质间的遗传差异，并进行聚类分析，明确其亲缘关系，以中粒种咖啡24-1和咖啡6号杂交F1代为作图群体，构建咖啡RAPD、SSR和ISSR等分子遗传连锁图谱，为咖啡重要性状的QTL定位及分子标记辅助育种奠定理论基础。

咖啡是我国热区主要经济作物之一，遗传多样性分析及遗传连锁图谱构建研究对于咖啡育种和遗传研究具有重要意义，是分子标记辅助选择、QTL精确定位的基础，基因图位克隆的关键，也是加快咖啡育种进程，提高咖啡育种水平的重要途径。本研究开展了DNA提取方法和最适PCR反应体系的研究，从分子水平上对我国收集保存的咖啡种质资源进行多样性分析，研究品种、类型之间的亲缘关系；利用优良品种24-1和6号的杂交Fl代为作图群体，构建了分子标记遗传图谱。研究表明，采用经过改良的CTAB法，提取的DNA能满足后续分子生物学研究的要求。运用均匀设计确定咖啡PCR反应体系，其中ISSR和RAPD-PCR反应体系为20 μl反应体系中，DNA模板20 ng，Mg2+ 1.5 mmol/L，dNTP 0.3 mmol/L，DNA Taq聚合酶1.25 U，引物 0.6 μmol/L，SSR-PCR最佳体系为20 μl反应体系中，DNA模板 30 ng，Mg2+ 1.0 mmol/L，dNTP 0.15 mmol/L，DNA Taq聚合酶0. 5 U，引物 0.6 μmol/L；不同咖啡种质之间的遗传相似系数在0.52~1.00（RAPD）、0.61~0.99（ISSR）和0.76~1.00（SSR），表现出较高的遗传多样性。供试品种在RAPD标记聚类图0.64的相似水平下，将159份咖啡种质划分为四个类群。在ISSR标记聚类图相似系数0.65处，供试品种可分为3个主要类群，在SSR标记聚类图相似系数0.79处，92份供试品种可分为4个主要类群。RAPD、ISSR和SSR三种标记均表明，小粒种、中粒种、大粒种咖啡之间存在较大的种间遗传差异，而在种内遗传差异较小，尤其是小粒种咖啡，种内遗传差异更小。用JoinMap 4.0软件中的CP作图模式构建了咖啡的分子标记遗传连锁图谱。该图谱覆盖咖啡基因组240.7cM，共计30个RAPD标记、21个SSR标记分属11个连锁群上，每个连锁群包含2～25个标记，标记间平均距离为4.72cM。各连锁群的长度在1.9~103.7cM，标记间最大间距36.8cM，最小间距0.2cM。