miR-221调控大肠癌干细胞干性和增殖、侵袭、迁移的分子机制及四神丸的干预研究

Recurrence and metastasis is the bottleneck of curative effect and long-term survival in colorectal cancer(CRC). Cancer stem cells(CSCs) stemness is considered to play an important role on recurrence and metastasis. However, the mechanism remains elusive. Our preliminary research indicates that miR-221 may be involved in CSCs stemness and biological characteristics. The significance of miR-221 in cancer biological processes is becoming apparent. Sishen Pill, one of the most famous Traditional Chinese Medicine used to therapy CRC, may inhibit CSCs by interfering miR-221. Therefore we focus human CRC-CSCs as the research subject to verify the effect of miR-221 and Sishen Pill. We plan to assess the interference of expressing and repressing miR-221 on stem cell sphere-forming capacity, stemness associated genes expression, cell proliferation, migration, invasion in vitro and in vivo by Gene transfection, RT-qPCR, Western blot, small animal PET/CT, bioinformatics and other technical methods. This project is a further research on the regulation of miR-221 and Sishen Pill on CRC based on our previous research. We expect our research may provide a scientific evidence of anti-tumor curative effect of Sishen Pill.

大肠癌术后复发转移是影响患者疗效和长期生存的瓶颈。肿瘤干细胞（CSCs）是大肠癌复发转移的重要因素，但其机制尚不清楚。我们前期研究发现，miR-221可能是大肠癌CSCs维持干性和生物学特性的重要调节因子，而四神丸可抑制大肠癌CSCs。本项目拟以人大肠癌CSCs为研究对象，采用体外与体内实验相结合方法，应用基因转染、实时定量RT-qPCR、Western blot、小动物PET/CT等技术方法，研究过表达/抑制miR-221对大肠癌CSCs肿瘤球形成能力、干性相关基因表达、体内成瘤及转移等指标的影响，多层次多途径验证miR-221与大肠癌CSCs之间存在的生物介导及效应靶向关系以及中药四神丸抑制大肠癌复发转移的作用机制。本项目是对前期miR-221调控大肠癌细胞侵袭转移研究的进一步深入，也为中医应用四神丸从肾论治大肠癌复发转移理论提供了科学依据，同时也为中西医结合抗肿瘤治疗提供了新的思路。

大肠癌术后复发转移是影响患者疗效和长期生存的瓶颈。肿瘤干细胞（CSCs）是大肠癌复发转移的重要因素，但其机制尚不清楚。本项目研究结果显示，大肠癌癌组织中miR-221、miR-196a、miRNA-92a较正常组织相对表达量显著升高；通过无血清培养的方法初步筛选了人大肠癌细胞SW480、SW620，采用免疫磁珠法二次过柱筛选分离80%表面标记为CD133+人大肠癌SW480细胞株CSCs，qRT-PCR、Western blot 鉴定分离获得的大肠癌CSCs干性标志物的表达较贴壁肿瘤细胞明显增高，且CD133+人大肠癌CSCs致瘤能力明显较CD133- CSCs强；X线照射联合四神丸治疗可显著抑制体内外CSCs侵袭迁移，并能改善肿瘤小鼠一般状况、提高长期生存率及改善体重降低；miR-221可促进CSCs细胞增殖，抑制其表达可抑制细胞增殖，四神丸含药血清可加速CSCs细胞凋亡、抑制Bmi-1表达。本项目进一步探讨了miR-96-5p、miR-92a调控大肠癌侵袭、迁移、耐药发生的机制。通过生物信息学数据库及细胞学研究发现，CSCs中miR-96-5p表达上调，PAK3是miR-96-5p的靶基因，大肠癌顺铂耐药可能与CSCs外泌体释放诱导肿瘤微环境改变密切相关；大肠癌组织中miR-92a表达也升高，且与大肠癌患者长期预后不良相关，RECK基因是miR-92a的直接靶标，miR-92a通过RECK-MMP信号通路促进CRC的侵袭和迁移。本项目的开展进一步证实了大肠癌肿瘤干细胞CSCs是导致结肠癌侵袭迁移等恶性生物学行为的核心因素，多种小分子miRNAs在介导大肠癌CSCs发生及耐药发生起到关键调控作用，中药四神丸抑制CSCs有明确作用。