基于“脾肾相关”理论从Ghrelin信号通路研究四神丸调节胃肠运动的作用机制

Irritable bowel syndrome with diarrhea (IBS-D) belongs to the category of TCM “diarrhea”.Psychological factors is one of the important mechanism of its pathogenesis on regulation gastrointestinal movement through brain-gut axis. The kidney equal to brain of TCM making the theory of“correlation of spleen and kidney” closely relate to brain-gut axis of modern medical. Our previous study found, ghrelin (Ghrelin) plays an important role in the control of gastrointestinal motility, but the molecular mechanism of Ghrelin signaling pathway mediated gastrointestinal smooth muscle still lack a complete research. Based on the theory of“correlation of spleen and kidney”,Sishen pill is a classical prescription for the clinical treatment of diarrhea with deficiency of spleen and kidney.But the mechanism is still not clear. Therefore, this project intends to start with the Ghrelin signaling pathway of brain-gut axis control, using the method of molecular biology technology and function evaluation. Using in vivo experiment to research the effect mechanism of Sishen pill in gastrointestinal motility of model rats by Ghrelin signaling pathway. Using the vitro experiment to observe the effect of Sishen pill medicated serum on vitro gastrointestinal smooth muscle contractile activity in the Ghrelin signaling pathway blocker intervened.Which will provide the experimental evidence to reveal the target of Sishen pill and expound the scientific connotation with theory of“Correlation of spleen and kidney”.

腹泻型肠易激综合征（IBS-D）属中医“泄泻”的范畴，精神心理因素通过脑肠轴对胃肠运动的调控是其发病的重要机制之一。中医肾通于脑使得“脾肾相关”理论与现代医学脑肠轴密切相关。我们前期研究发现，胃促生长素（Ghrelin）在胃肠运动调节中具有重要作用，但目前关于Ghrelin信号通路介导胃肠平滑肌运动的分子机制仍缺乏完整的研究。基于“脾肾相关”理论组方的四神丸是临床治疗脾肾阳虚型泄泻的经典方剂，但其作用机制尚不明确。因此，本项目拟从脑肠轴调控下的Ghrelin信号通路入手，运用分子生物学技术和功能评价方法，采用在体实验，研究四神丸在Ghrelin信号通路介导下，调节脾肾阳虚泄泻模型大鼠胃肠运动的效应机制；采用离体实验，观察在Ghrelin信号通路阻断剂干预下，四神丸含药血清对离体胃肠平滑肌条收缩活动的影响。为揭示四神丸的作用靶点及阐述“脾肾相关”理论的科学内涵提供实验依据。

本研究基于“脾肾相关”理论和脑肠轴的关键环节，以脑肠肽Ghrelin信号通路为切入点，以益火补土法的代表方剂四神丸为研究对象，根据前期“以方（四神丸）测证（脾肾阳虚）”研究思路的可行性，从动物在体和离体实验出发，运用功能评价方法和免疫组化、WB、RT-PCR等现代分子生物学技术，研究了四神丸在Ghrelin信号通路介导下调节脾肾阳虚泄泻大鼠胃肠运动的效应机制。.整体动物实验结果显示，四神丸能改善模型大鼠的一般状态，增加体质量、调节脏器指数；通过增加胃内残留率、降低腹泻指数和小肠推进率而抑制胃肠运动；四神丸能降低模型大鼠血清Ghrelin和胃窦、十二指肠组织IP3含量，降低胃肠SMC内Ca2+浓度，抑制胃肠肌球蛋白Mg2+-ATPase活性；四神丸能下调模型大鼠下丘脑、脊髓、胃窦、十二指肠组织中的Ghrelin及其受体GHSR的蛋白和基因表达，并能降低胃肠组织中Ghrelin信号通路指标PLC、CaM、MLCK的蛋白和基因表达，且以四神丸高剂量组作用最为明显，而四神丸中剂量组与得舒特组比较差异不显著。.离体组织实验结果显示，四神丸血清剂量为5-100ul时，胃窦环行肌和十二指肠纵行肌收缩呈剂量依赖性减弱，而四神丸剂量增至150ul和200ul时，胃肠肌条收缩曲线趋于平坦，曲线下面积变化率与100ul比较差异无显著性。在分别加入[D-Lys3]-GHRP-6、U-73122和ML-9干预后，胃肠肌条收缩活性与基础状态相比无明显变化，继续加入梯度剂量的四神丸血清，肌条收缩活性虽然仍呈剂量依赖性减弱，但量效曲线较单用四神丸血清显著上移。.以上研究结果表明，四神丸可引起机体在下丘脑、脊髓、胃肠三个不同层次中的Ghrelin及其受体发生变化，四神丸可通过Ghrelin信号通路的介导而影响胃肠平滑肌运动。为明确四神丸调节胃肠运动的作用靶点及阐释中医“脾肾相关”理论的脑肠轴机制提供了实验依据。