重组HDL-药物复合物肝靶向性及其分子机制研究

高密度脂蛋白（HDL）是血浆中的重要脂蛋白，由载脂蛋白、卵磷脂和胆固醇（酯）组成，其生理作用主要是"胆固醇逆向转运"至肝脏。载脂蛋白AI（apoAI）是其主要载脂蛋白，约占70%，是HDL功能的主要完成者。肝细胞表面有apoAI特异性受体, 因此apoAI是一潜在的主动肝靶向材料。本课题即利用基因工程表达的人源apoAI、卵磷脂、脂溶性药物（代替胆固醇酯），模拟体内HDL组成及形成过程，制备重组HDL药物复合物,研究其肝靶向性及分子机制。在细胞和分子水平确证重组HDL药物复合物肝靶向特异性、在血液输送过程的变化、对血液成分的影响、细胞内吞、胞内释药过程、复合物粒径对靶向特异性的影响及体内药效研究，为新型靶向材料的研究提供理论依据和相关方法。

本研究内容以载脂蛋白A-Ⅰ为载体，水溶性抗肿瘤药盐酸阿霉素为模型药，用原位肝癌动物模型，研究了载脂蛋白A-Ⅰ体内外肝靶向性及治疗效果，结果表明载脂蛋白A-Ⅰ有较好的肝靶向性，且体外安全性良好。首先制备重组高密度脂蛋白-盐酸阿霉素复合物(rHDL-DOX)，结果表明，pH法由于可操作性及包封率差而不适用于重组制备；薄膜分散法所得制品平均粒径为59.70 nm ± 4.50 nm，包封率为20.20% ± 4.17%；硫酸铵梯度法所得制品平均粒径为113.80 nm ± 10.29 nm，包封率为83.33% ± 8.45%。制备的rHDL-DOX体外表征良好，冻干品的稳定性好。同时体外溶血性实验证明rHDL-DOX无溶血性。以佛波酯诱导THP-1细胞形成的巨噬细胞检验rHDL-DOX的细胞相容性，结果表明rHDL-DOX不会诱导巨噬细胞产生相关炎症因子，反而下调MMP_2、COX2等炎症介质的表达，上调PPAR-a的表达。ELISA分析细胞上清液与mRNA水平检测结果一致。显示rHDL-DOX不会刺激巨噬细胞产生炎症因子，引起相关免疫反应，反而可以下调部分炎症因子的表达，作为载体材料有良好的生物相容性.rHDL-DOX体内外肝靶向性。体外肝靶向性通过多种细胞株对rHDL-DOX吸收进行定量比较，结果显示肝癌细胞对rHDL-DOX有更强的吸收结果，rHDL-DOX对人肝癌细胞有更强的杀伤作用。同时利用荧光标记手段定性考察了apoA-Ⅰ在介导药物进入细胞的作用，结果荧光显微镜下观察到含有apoA-Ⅰ的rHDL-Rh6G比OL-Rh6G在细胞内具有更强的荧光强度，进一步证明该结果由于apoA-Ⅰ的介导而产生的。体内肝靶向性通过考察大鼠药时曲线与组织分布实验进行比较，实验结果表明，rHDL-DOX在大鼠体内半衰期长，消除半衰期t1/2β分别是OL- DOX的1.25倍，药时曲线下面积AUC(0-∞)是OL- DOX的2.58倍。同时与free DOX比较，rHDL-DOX的肝脏相对摄取率Re=1.824，高于其他组织。这些结果均提示rHDL-DOX能够靶向将DOX带到肝脏部位进行代谢，具有体内靶向性特点。.本课题进一步研究了rHDL-DOX在用于治疗肝癌的实际效果，通过MTT手段比较不同药物对肝癌细胞的活性，同时建立裸鼠原位肝癌模型，以裸鼠体重和肿瘤大小变化为主要考察指标，评