HDACIs对脊髓损伤后内源性神经发生的影响及作用机制研究

内源性神经干细胞（NSCs）的存在为脊髓损伤（SCI）后细胞替代治疗带来了新希望，但因神经元分化比例过少，内源性神经发生对SCI后神经功能恢复作用有限，且SCI后NSCs分化的调控机制未明，无法施加积极的干预措施。最新研究发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACIs）对某些干细胞的分化有重要的调控作用，能促进脑卒中后的神经功能恢复，但具体机制不详。因而本项目拟研究HDACIs对SCI后内源性神经发生的调控作用，运用免疫荧光、Western Blot、原位杂交、RT-PCR、RNA干扰等方法观察组蛋白乙酰化修饰对SCI后内源性NSCs分化的影响，并对神经发生起关键调控作用的Wnt/β-catenin信号通路在这其中的作用进行重点探讨，以阐明HDACIs调控SCI后神经发生的具体分子机制。本项目的研究将为以激发机体内源性修复潜能的SCI治疗新策略奠定实验基础，也为其他神经损伤修复研究提供借鉴。

背景与目标：脊髓损伤（spinal cord injury, SCI）在全球每年的发病率为0.002%-0.004%，每年新增约十余万病人，现有约250万患者。脊髓损伤后患者的生活能力低下，给家庭和社会造成沉重的负担，目前尚缺乏正真有效的治疗手段。成年神经干细胞（neural stem cells,NSCs）的发现为脊髓损伤后的细胞替代治疗带来了新的曙光，但自然状况下SCI后内源性神经发生的水平较低，且不能形成有效的神经通路，对神经功能恢复作用有限，具有较大的干预空间。表观遗传机制在调控细胞增殖与分化方面有特殊作用，而最近有关组蛋白乙酰化修饰的研究进展则为我们研究NSCs分化调控机制以及干预SCI后内源性神经发生提供了理想的切入点。研究发现，组蛋白去乙酰化酶抑制剂（histone deacetylase inhibitors，HDACIs）如丙戊酸(valproic acid, VPA)、曲古抑菌素A能促进缺血、外伤后的神经功能恢复，具有一定的神经保护作用，具体机制尚不清楚。因而，本项目观察给予HDACIs——VPA 干预后SCI大鼠神经功能恢复变化，并探讨内源性神经再生及相关机制。方法：动脉瘤夹夹持法建立SD(Sprague Dawley)大鼠脊髓损伤动物模型，予以150 mg/kg VPA 2/d，连续14d，于伤后1w、2w、3w、4w、5w、6w、7w、8W分别进行BBB（Basso–Beattie–Bresnahan）评分和下肢运动诱发电位（Motor evoked potentials，MEPs)和体感诱发电位（somatosensory evoked potentials, SEPs)检测；行PCR、Western Blot以及免疫荧光染色观察内源性NSCs增殖及分化情况；离体培养SCI后大鼠成年脊髓神经干细胞，予以VPA处理，检测NSCs细胞增殖及分化情况；流式细胞仪测定VPA对NSCs细胞周期影响，测定细胞周期调控因子 P21基因及蛋白表达。结果：相比SCI对照组，VPA干预组的BBB评分更高，MEPs和SEPs峰潜伏期更接近假手术组；基因及蛋白水平检测均显示VPA干预没有影响神经干细胞标志物Nestin的表达，但显著增强了新生神经元标志物DCX(doublecortin)表达；在培养的成年SCI大鼠NSCs中，VPA呈剂量依赖性的抑制了NSCs的