甲壳类水产品中内源性氨基脲的产生机理及分子调控标志物识别研究

Endogenous semicarbazide (SEM), which occurs naturally in crustaceans, brings serious problem of false positive interference obsessing the industry for the detection of nitrofurazone. The clarification of the formation mechanism of SEM in crustaceans and the establishment of effective identification method can help solve the existing problems. By taking different crustaceans as raw materials to clarify the formation mechanism of SEM through experiments and backward chaining, the producing conditions of endogenous semicarbazide are analyzed, bond state SEM is dissociated by chemical approach, and biological precursor or intermediate is obtained by the combination of proteomics techniques, high resolution mass spectrum and chemical simulation experiment. Effective identification method is established by analyzing the differences of pathway of SEM formation between biological precursor or intermediate and nitrofurazone metabolism. The research provides an effective approach to solve the problem of the false positive of the detection of nitrofurazone in crustaceans, and lay the scientific foundation for the future development of the elimination technology of SEM in crustaceans.

目前甲壳类水产品中内源性氨基脲(semicarbazide，SEM)的天然存在为呋喃西林药物检测带来了严重的假阳性干扰行业难题，破解现有难题有赖于阐明甲壳类水产品中内源性SEM的产生机理并建立有效的识别分析方法。本项目拟选择不同来源甲壳类水产品为研究对象，分析内源性SEM产生的条件，通过化学方法解离结合态SEM，采用蛋白组学结合高分辨质谱技术以及化学模拟实验获得其生物前体或中间体，通过实验并逆向推理阐明其在甲壳类水产品中的产生机理；进一步研究前体/中间体与呋喃西林代谢产生的SEM途径之间的差异，获得特异性分子调控标志物，建立有效的识别、分析方法，从源头上进行内源性SEM的识别。研究结果为解决甲壳类水产品中呋喃西林药物检测的假阳性问题提供有效途径，为后续开发甲壳类水产品SEM消除技术奠定科学基础。

目前甲壳类水产品中内源性氨基脲的天然存在为呋喃西林药物检测带来了严重的假阳性干扰，破解现有难题有赖于阐明甲壳类水产品中内源性氨基脲的生成机理。本项目选择不同来源甲壳类水产品为研究对象，分析内源性氨基脲产生的条件，获得非呋喃西林源氨基脲的存在和分布情况及其存在状态和转化过程。利用代谢组学结合高分辨质谱技术以及化学模拟实验获得其生物中间体，通过实验并逆向推理阐明其在甲壳类水产品中的产生机理，从源头上进行内源性SEM的识别。研究结果发现：1、海水甲壳类水产品中的肌肉中均不含氨基脲，而淡水甲壳类水产品则均含有少量的氨基脲。含有氨基脲的五种海水虾蟹样品均在外壳和内脏中发现含有氨基脲，其含量分布呈现出外壳>内脏的趋势。推断海水甲壳类水产品的氨基脲来源于外壳和内脏。2、研究发现4种可能的甲壳类水产品中非呋喃西林氨基脲的产生途径，包括水体环境中富集、迁移；加热过程产生；次氯酸盐处理产生以及偶氮甲酰胺面粉裹粉产生。3、利用代谢组学技术分析了克原氏螯虾体内氨基脲的代谢组学特征。结果显示，经药浴后克原氏螯虾肌肉组织中氨基脲的检测量呈现随时间延长而增多。在经呋喃西林处理24h后的样品与4h样品相比，共注释到到39个代谢差异物质，其中22个上调，17个代谢差异物下调表达。KEGG富集通路表明，暴露影响精氨酸生物合成、谷氨酸代谢等相关的通路。4、通过建立模拟化学体系，研究了氨基酸转化成氨基脲的可能机制。发现精氨酸、赖氨酸导致氨基脲的生成量增多，并且伴随新的聚合物吖嗪的生成，并分析推测得到-CONH2是生成氨基脲的一个关键中间体结构。5、以5-硝基-2-糠醛为特异性生物标识物，初步研究开发了一种用于鉴别蟹、虾等甲壳类动物中呋喃西林和非呋喃西林源SEM的UPLC-MS/MS检测方法。研究结果揭示了内源性氨基脲的产生机理，并为甲壳类水产品中呋喃西林药物检测假阳性问题提供有效鉴别途径，有重要的科学和应用价值。