多靶位抑制谷氨酸NMDA受体活化-钙超载信号通路对难治性癫痫多药耐药干预作用初探

难治性癫痫的发病机制复杂、治疗效果不佳，对常规抗癫痫药物多具有耐药性。目前已获认识的多药转运体MDTs相关"多药耐药假说"至今仍停留于理论阶段；本课题前期工作发现谷氨酸及其NMDA受体活化参与了难治性癫痫模型MDTs的过度表达，提出癫痫发作后诱导的谷氨酸-NMDA受体活化-钙超载信号转导通路可能是引起脑内多种MDTs表达增高，最终导致耐药性产生的中心环节；研究拟结合离体及在体实验，通过对耐药性模型进行层层干预、选择性阻断上述信号通路的不同位点，综合分析比较其对主要MDTs表达、功能活性状态以及脑内AEDs药物浓度变化的影响，探讨上述信号转导通路在难治性癫痫MDTs相关多药耐药形成过程中的调控作用，进一步寻求多靶位抑制MDTs相关耐药的有效干预途径，探索同时逆转多种主要MDTs表达的关键环节，从而可能为发现难治性癫痫耐药形成的新理论及拓展治疗的新途径提供实验基础和理论依据。

对于第一部分的实验，首先构建氯化锂-匹鲁卡品边缘叶癫痫大鼠在体模型，探讨癫痫持续状态SE终止后72小时内P-gp、Mrp2、Bcrp等MDTs基因及蛋白表达的时间规律，结果提示在SE终止后72小时内上述基因与蛋白表达均呈现先高后低的趋势，3种MDTs的mRNA表达均在SE终止后6小时最高，蛋白表达在24小时最高，故认为癫痫发作诱导MDTs暂时性过度表达；然后选择谷氨酸NMDA受体拮抗剂MK801进行干预，观察其对于上述MDTs表达的影响，结果显示，MK801干预组上述3种MDTs的表达均较SE组有明显下降，证实NMDA受体拮抗剂MK801能逆转癫痫发作后MDTs的过度表达；另外还构建了谷氨酸刺激诱导的离体RBMECs细胞模型，对于该细胞上mrp2这种MDTs的表达与外排转运功能进行测定，结果发现在接受谷氨酸刺激以后RBMECs上mrp2的mRNA表达水平明显高于control组和MK801组，底物外排实验结果显示谷氨酸刺激组细胞内外荧光强度比值高于对照与MK801组，提示谷氨酸刺激可诱导RBMECs高表达mrp2并增强其外排转运功能，NMDA受体拮抗剂可以逆转这一作用。第二部分实验，我们建立了谷氨酸诱导RBMECs高表达P-gp的细胞模型，使得其mdr1a及mdr1b的转录水平增高，然后应用MK801显著降低mdr1a、mdr1b mRNA转录水平及P-gp表达水平；随后检测谷氨酸受体活化后下游信号传导通路Eef-2k蛋白表达水平及磷酸化水平均有增高，这种增高能够MK801所抑制，提示对NMDA受体进行干预可能通过下游激酶Eef-2k及延长因子参与对P-gp的调控；接下来通过NH125抑制剂对Eef-2K进行直接干预，观察到NH125能显著降低谷氨酸刺激细胞模型中P-gp的表达水平、也能显著降低Eef-2K的磷酸化水平，从而抑制谷氨酸刺激RBMECs高表达P-gp的效应。第三部分纳米实验中，我们利用Pluronic胶束作为材料包裹抗癫痫药物构建一种基于逆转多药耐药的纳米递药体系，结果显示这种裹药纳米胶束稳定性较好，能够增加药物透过血脑屏障入脑的比例，这种效应可能是逆转了针对MDTs所产生的多药耐药机制所形成的后果。课题设计三部分实验中的主要内容均已基本完成。