低氧介导的代谢重编程对维持血管内皮祖细胞干性的作用及机制

Endothelial progenitor cells (EPCs) have been proved to be effective in promoting tissue and functional repair in ischemic diseases. However, the recent widely used method for expansion of EPCs under normoxia (~20%) is not benefit for maintenance of cell stemness due to oxygen shock. Our previous study has found that culture under 1% hypoxic condition was conducive to the maintenance of stemness of EPCs. We also found that p53 pathway was involved in this process according to the result of the whole transcriptase sequencing analyzing the differential expression. Since p53 is closely related to cell metabolism and metabolic reprogramming is closely related to cell stemness, this study will: 1. detect the metabolic status of EPCs cultured under the two different oxygen concentrations; 2. detect the effects of p53 on EPCs metabolic reprogramming and cell stemness under different oxygen concentrations; 3. examine the effects of inhibiting glycolysis or mitochondrial respiration by chemical drugs on the stemness of EPCs. Thereby, we will explore the role and mechanism of hypoxia mediated metabolic reprogramming on maintaining the stemness of EPCs. The study will help to understand the biological characteristics of EPCs, to improve the expansion method for EPCs and to improve the therapeutic efficacy for ischemic disease. Thus, this project not only has important scientific significance but also has good clinical translation value.

血管内皮祖细胞(EPCs)能有效地促进多种缺血性疾病的组织与功能修复。然而，常规的在常氧条件下(~20%)扩增EPCs因氧应激而不利于干细胞干性的保持。我们前期研究发现1%低氧条件下培养有利于维持EPCs的干细胞干性。通过全转录组差异表达分析，我们发现p53信号通路参与其中。由于p53与细胞代谢关系密切，而代谢重编程与干细胞干性关系密切，本研究拟：1.检测这两种不同氧浓度下培养的EPCs的细胞代谢状态；2.检测p53对不同氧浓度下EPCs代谢重编程及干细胞干性的作用；3.检测以化学药物抑制糖酵解或抑制线粒体呼吸对EPCs干细胞干性的影响。从而探讨低氧介导的代谢重编程在EPCs干细胞干性维持中的作用和机制。本项目不仅将增进对于EPCs生物学特性的了解，而且有助于改进EPCs体外扩增方法，提高对于缺血性疾病的治疗效果，兼具重要的科学意义以及良好的临床转化价值。

骨髓源血管内皮祖细胞(EPCs)能有效地促进血管再生，并已显示出对于多种缺血性疾病安全有效的治疗效果，提示了其良好的临床应用前景。然而，目前广泛采用的常氧条件下(~20% O2)的扩增方法因氧应激而不利于干细胞干性的保持。在本研究中，我们发现1%低氧条件下扩增EPCs较常氧条件，能有效减少细胞衰老，提高EPCs的增殖、迁移和成血管能力。通过细胞代谢通量分析、液相色谱质谱仪（LC-MS）检测代谢物，以及通过高压/高效液相色谱质谱仪 (HPLC-QE-MS)来示踪13C 标记的葡萄糖的碳走行等方法，我们证实低氧条件较常氧条件下细胞发生了糖代谢重编程，主要表现为糖酵解及磷酸戊糖途径增强，而三羧酸循环（TCA）及线粒体呼吸减弱；为进一步探讨代谢重编程与干细胞干性维持的分子机制，我们发现在低氧条件下，EPCs的乳酸脱氢酶（LDH）同工酶谱发生了迁移，表现为低氧下相对有更多的LDH5和LDH4，更少的LDH2和LDH1。而且，低氧下细胞具有更高的LDH的酶活性，有利于丙酮酸向乳酸的转化，促进烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)再循环，进而促进线粒体自噬而减缓细胞衰老。我们还发现，低氧条件下，EPCs正向TCA减弱，逆向TCA增强。这种柠檬酸脱氢酶 (IDH)-1和IDH-2依赖性的逆向TCA增强促进了脂肪酸从头合成，提高了EPCs增殖和成血管能力。此外，我们还发现了几个有效的通过干预细胞的代谢来实现对EPCs干性调节的靶点，比如，通过化合物来抑制线粒体丙酮酸转运载体、柠檬酸合成酶、或α-酮戊二酸脱氢酶等，可以在常氧条件下模拟低氧环境，诱导细胞发生有氧糖酵解，也能有效的提高EPCs的干性。总之，我们的研究拓宽了我们对于EPCs生物学特性的了解，有助于改进传统的EPCs体外扩增方法，提高对于缺血性疾病的治疗效果，兼具重要的科学意义以及良好的临床转化价值。