神经嵴干细胞结合基因编辑对巨结肠模型鼠的移植治疗探索

Hirschsprung's disease（HD）is a common neuron disease in pediatric surgery，also called aganglionsis. It is caused by the developmental failure of the enteric neural system （ENS）progenitors during migration into the gastrointestinal tract, particularly the distal colon. To this day, HD is only treated by surgical procedure with many possible complications. To mimic the HD in research, two HD model were established based on genetic and environmental elements individually. Stem cell is promising for HD therapy. To explore the treatment for HD, we isolate the pure sensory neural progenitors or NCSC-like progenitors from ESCs or IPS first, then differentiated into functionally active sensory neuron in vitro, and showed the evidence of nNOS and Synaptophysin expression when we transplanted these progenitors into enteric explants after 7 days. Another candidate NCSCs from postnatal mice were also isolated and proliferated with differentiation and electric physiology evidence as neuron. Genome editing combined with both candidate cells were proposed to explore the potential to cure genetic HD in vivo, specially on the EDNRB(-) HD model. Our proposal and research will explore new strategy for HD remedy, get some positive result in vivo, and function regeneration in cells and gut possibly.

先天性巨结肠(HD)又称肠无神经节细胞症，是小儿外科常见急重症，是由于发育过程中肠神经嵴干细胞（NCSC）或重要基因的问题，导致NCSC在移行、分化、发育的过程中发生缺陷所致，一般由环境或遗传因素所导致。目前HD只能靠外科手术治疗，并有很多潜在并发症。为模拟临床问题，基因缺陷型和获得性HD模型得到了建立。干细胞的研究进展，为应用该技术治疗HD带来新的可能治疗途径。本课题组利用诱导多能干细胞诱导出纯化的神经前体细胞或类神经嵴前体细胞，并进一步分化出具有电生理活性的感觉神经细胞，在体外移植后得到了Synaptophysin以及特征性神经元nNOS的标记；其次已获取并培养出典型特征的肠NCSC。在两种神经嵴干细胞的基础上，为进一步解决先天遗传性问题，设计结合基因编辑，尝试解决EDNRB缺陷型小鼠的HD疾病。该课题的设计和完成，有望对HD疾病的治疗进行良好的探索，产生好的体内数据甚至再生修复。

肠神经系统是相对独立的自主神经系统，由内外两层神经丛组成，包括肌间神经丛和粘膜下层神经丛，调节肠的各种功能，包括肠动力，肠上皮细胞分泌，以及肠道中营养物质的吸收等。肠神经系统在发育上起源于神经嵴细胞。而许多先天的或后天的原因会导致肠神经元的减少甚至缺失，从而引起肠神经系统疾病的发生。其中巨结肠疾病（HSCR）就是临床上常见的一种先天性肠神经系发育异常性疾病，因为发育过程中神经嵴细胞迁移、分化或增殖出现障碍，导致肠道神经节细胞缺如，从而引起肠动力功能障碍。目前关于巨结肠疾病的治疗手段主要为手术切除，但术后仍然有诸多并发症可能，如便秘、反复小肠结肠炎、肠粘连肠梗阻甚至大便失禁等，严重影响病人的生活质量。而干细胞移植有望替代缺如的神经元，成为一种新的治疗方法。之前研究表明肠组织中可以分离纯化出神经前体细胞，这部分细胞移植到结肠内，表现出存活，迁移，分化并与内源的平滑肌建立神经突触联系，甚至恢复nNOS神经缺失模型鼠的功能。这些结果说明干细胞治疗肠神经疾病的可能性。但由于受细胞来源和细胞数量的限制，细胞治疗到临床应用还有许多问题需要探究。我们的研究，主要目的是提供更多来源细胞，为细胞治疗肠神经疾病提供更多的可能。我们的课题基于肠神经系统发育上来源于神经嵴干细胞，而成体多种组织中有神经嵴干细胞的存在，从而假设其它非肠组织部位中分离出的神经源的干细胞移植到肠道是否有分化成肠神经元的可能。. 我们首先以背根神经节作为细胞获取的组织来源。体外分离纯化出背根神经节来源的神经前体细胞。免疫荧光实验分析显示背根神经嵴来源的细胞表达神经嵴干细胞的分子标记 SOX10，P75等，并表达神经干细胞的分子标记Nestin。体外分化实验显示，背根神经嵴来源的细胞可以分化成神经元和胶质细胞，并有少量表达肠特异性神经元分子标记nNOS。进一步将背根神经嵴来源的细胞移植到成体小鼠结肠中，我们发现移植的细胞在体内能够存活，迁移，分化，并与内源的肌肉和神经元建立突触联系。通过钙成像实验，表明移植的细胞在体内具有神经电生理活动。. 考虑到临床应用的现实性，我们分离了源于小鼠皮肤的神经干细胞，同样证明这部分细胞可以于肠中生存，分化，整合并重建肠神经。为了验证干细胞恢复肠动力的功能，我们利用肠类器官与神经干细胞的共培养已经证明小鼠皮肤来源的神经干细胞具有重建肠类器官神经系统并调节肠动力的能力。