神经上皮干细胞与Cajal间质细胞共移植治疗先天性巨结肠病的实验研究

先天性巨结肠病（HD）是以消化管神经运动障碍为特征的一种先天畸形，主要病理变化为病变肠管的壁内缺乏神经节细胞，Cajal间质细胞（ICC）减少。我们在HD动物模型上成功地完成了"神经上皮干细胞移植治疗HD的实验研究"，研究结果显示，神经上皮干细胞在移植部位存活并分化为功能性肠神经节细胞，肠神经运动功能明显改善，但未能完全恢复；我们还成功地分离培养了Cajal间质细胞，并完成了Cajal间质细胞与HD发病的相关性研究。在此基础上，本项目拟在HD动物模型上，通过NESCs与ICC共培养、共移植，检测体外共培养时两种细胞的存活的分化情况以及移植细胞在肠壁微环境中存活、分化和功能状况、观察细胞移植后的治疗效果，从而进一步证明HD的发病与神经节细胞及ICC的关系，并为HD的治疗开辟一条新路。

在三年的研究工作中，本课题组成功地进行了鼠胚神经管来源的神经上皮干细胞（Neuroepithelial stem cells，NESCs）和新生鼠结肠肌层的Cajal间质细胞（Interstitial cell of Cajal, ICC）的提取及体外共培养，检测了共培养后两种细胞的存活及分化情况；同时建立了鼠无神经节细胞性巨结肠病 (Hirschsprung’s disease，HD)模型，并将Brdu标记的NESCs及DAPI标记的ICCs进行了肠壁内共移植，移植后对两种细胞的存活、分化及肠神经运动功能进行了检测。结果显示：共培养的NESCs能分化为PGP9.5阳性的神经细胞和GFAP 阳性的神经胶质细胞，神经细胞的分化率较单独培养时明显增高，并能分化为神经型一氧化氮合成酶（nNOS）和乙酰胆碱转移酶（ChAT）阳性的神经细胞；共同培养的ICC存活良好，呈c-kit阳性，并与分化的NESCs连成了网络样结构，共培养4周后ICC的凋亡率较单独培养时明显减低；共移植的NESCs与ICC在肠壁内存活良好，NESCs分化为PGP9.5阳性的神经细胞和GFAP阳性的神经胶质细胞，PGP9.5阳性神经细胞的分化率较NESCs单独移植组明显增高；Western blot检测结果显示共移植组肠神经递质nNOS和ChAT的表达明显增高；结肠球囊扩张刺激反射实验及离体肌条电场刺激实验发现，NESCs与ICC共移植能明显改善肠神经运动功能。.本项目首次进行了神经上皮干细胞和Cajal间质细胞的体外共培养以及肠壁内共移植治疗先天性巨结肠病的实验研究，国内外均未见报道，课题完成后，进一步阐明了肠神经系统与ICC在发育过程中的相互作用，揭示了ICC对肠神经细胞的分化起到调控作用，从而拓宽和深化了关于HD乃至肠神经运动功能障碍性疾病发病机理的研究；并利用动物实验证明了肠壁内神经干细胞和ICC共移植治疗HD的可行性，证实了这两种细胞在肠壁内移植后有协同促进作用，为HD的细胞移植治疗开辟了新的途径。研究中所使用的一些技术方法，如Cajal间质细胞和神经干细胞的共培养、检测方法，HD动物模型的制作技术，肠壁内移植及检测技术等，将推动HD发病机理和干细胞移植治疗的深入研究。本项目已发表SCI 文章1篇（2篇文章修稿中），多次参加国际和国内会议交流，获山东省科技进步二等奖一项，培养了两名博士研究生。