GITRL调控Tfh细胞促进小鼠胶原诱导性关节炎发病的实验研究

研究表明GITR/GITRL可促进小鼠胶原诱导性关节炎（CIA）发生，但其作用机制尚不完全清楚。滤泡辅助性T细胞（Tfh）是新近发现的CD4+ T细胞亚群，对体液免疫具有重要的调控作用，Tfh细胞功能异常可促进自身免疫性疾病的发生。我们的研究发现Tfh细胞表面高表达GITR，体外GITRL可增加Tfh细胞比例，体内GITRL可增加CIA小鼠Tfh细胞数量和功能。由此，我们推测：GITRL可直接作用于Tfh细胞，促进其活化增殖，促使B细胞分泌大量自身抗体而加重CIA发病。本课题首先研究体外GITRL促进Tfh细胞活化增殖作用及其分子机制；第二，进一步明确GITRL对CIA的作用，了解Tfh细胞变化情况；第三，观察GITR融合蛋白阻断GITR/GITRL途径后，对CIA发病及Tfh细胞变化的影响。通过上述研究，将为阐明GITRL的免疫调控机制，以及寻找类风湿性关节炎治疗靶点提供理论和实验依据。

本课题在分离纯化的小鼠脾脏CD4+ T细胞培养体系中加入糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体的配体（GITRL）蛋白，观察该蛋白对滤泡辅助性T细胞（Tfh）的作用；利用胶原诱导的类风湿性关节炎（CIA）小鼠模型，体内注射GITR-Fc蛋白阻断GITR/GITRL 信号通路，观察其对CIA小鼠发病的影响、研究CIA小鼠体内Tfh细胞、CD19+ B细胞、CD138+浆细胞数量的变化、抗Ⅱ型胶原特异性抗体、脾脏及骨髓中抗体分泌细胞数量的变化。实验结果表明GITRL 可直接作用于Tfh 细胞，促进其活化增殖，抑制其凋亡，促使B 细胞分泌大量自身抗体而加重CIA 发病，GITR-Fc蛋白阻断GITR/GITRL 信号通路后能显著缓解CIA小鼠的疾病严重程度，在降低Tfh细胞增殖的同时抑制抗体分泌细胞的数量及自身抗体的表达水平，可作为CIA的免疫干预靶点。.收集类风湿性关节炎（RA）患者外周血，与正常对照组相比，RA患者体内可溶性GITRL（sGITRL）的表达水平和Tfh细胞的比例明显增加，相关性分析结果显示，RA患者外周血中Tfh细胞比例与抗环瓜氨酸抗体（Anti-CCP）水平呈正相关关系。与此同时RA患者外周血中Bcl-6 mRNA、IL-21mRNA和血清中IL-21的表达水平也均显著增加。为了研究GITRL在RA中促进Tfh 细胞活化增殖作用的分子机制，本课题通过生物信息学预测寻找调控Tfh细胞特异性转录因子Bcl-6的miRNA（miR-346），通过荧光素酶报告实验证实miR-346靶向作用于Bcl-6；明确miR-346与Bcl-6 3’-UTR的两个结合位点的作用强度。体外实验证实，人外周CD4+ T细胞过表达miR-346后会引起培养体系中CD4+CXCR5+ T细胞的比例明显下调，提示miR-346可能在RA的发生发展过程中起到了负向调控的作用。本研究进一步以表达Bcl-6的Jurkat细胞做为模型，使Jurkat细胞过表达miR-346，结果显示，miR-346在mRNA和蛋白水平上均抑制了Bcl-6的表达，表明miR-346可通过调控Tfh细胞在RA发生发展过程中发挥作用，进一步明确了RA的发病机制。