三倍体罗汉果种子败育分子机理研究

As a well-known traditional Chinese medicine, Siraitia grosvenorii possesses important medicinal value and vast development future. The diploid S. grosvenorii have too many seeds. It will be a new direction to get seedless S. grosvenorii by finding out and regulating abortion genes of triploid S. grosvenorii seeds. We put forward that its structure and chemical compounds such as endogenous hormones have certain rule in the process of seed abortion, and those changes mainly controlled by their internal genes. In order to verify the hypothesis, the study analyzes the seed abortion regularity and determines the critical periods of formation by observing the microscopic (submicroscopic) structures and detecting endogenous hormones of triploid S. grosvenorii seeds. High-throughput sequencing technology was used to analyze the transcriptome and excavate genes related with seed abortion of S. grosvenorii. Full length cDNA was cloned using the rapid-amplification of cDNA ends technique (RACE). And the functional verification of seed abortion genes were performed. The genes expression patterns were detected by quantitative reverse transcription PCR, aiming to validate accuracy of transcriptome. This study tries to analysis molecular mechanism of seed abortion of triploid S. grosvenorii, and to establish a theoretical basis for the breeding technology innovation of S. grosvenorii and even Cucurbitaceae.

罗汉果是著名的传统中药，具有重要的药用价值和广阔的开发前景。二倍体罗汉果种子太多；而通过研究三倍体罗汉果种子败育的分子机理，找出败育基因并对其进行调控，将是获得无籽罗汉果的新方向。故，我们提出三倍体罗汉果种子败育过程中其结构及内源激素的变化有一定的规律，而这些变化是由基因调控的假说。为了验证该假说，本研究拟通过观察三倍体罗汉果种子败育过程的显微与亚显微结构，测定内源激素的含量，进而分析败育种子形成的规律，确定其形成的关键时期；采用第二代高通量测序技术（Solexa）进行转录组测序，发掘调控三倍体罗汉果种子败育的关键酶基因，进行RACE克隆和时空表达模式分析，并进行过表达和干扰研究，明确败育基因的功能作用，从分子水平上揭示三倍体罗汉果败育种子的形成机理，为罗汉果乃至葫芦科植物育种技术的革新提供理论基础。

罗汉果是著名的传统中药，具有重要的药用价值和广阔的开发前景。二倍体罗汉果种子太多，这些种子增加了活性成分甜苷V利用的成本。因此，研究三倍体罗汉果种子败育的分子机理，鉴定败育基因并对其表达进行调控，将是获得无籽（少籽）罗汉果的新方向。在本研究中，我们调查了三倍体罗汉果种子败育过程的显微、亚显微结构。通过测定内源激素含量，我们发现在人工授粉后15天和20天时，脱落酸和玉米素水平显著下降。 开展不同发育阶段的败育种子转录组测序，以期鉴定三倍体罗汉果种子败育的关键调控基因。相邻发育时期的多个差异表达基因得到鉴定，其中7个基因在所有发育时期均差异表达。权重基因共表达网络分析表明，单萜和萜烯代谢过程的增强将减少底物合成ABA和ZR，并可能导致种子败育。通过RACE和RT-PCR技术克隆罗汉果脱氢抗坏血酸还原酶基因全长，其长度为1 252 bp，开放阅读框 (ORF) 为819 bp，命名为SgDHAR，GenBank登录号为KC907731，编码一条272氨基酸的肽链，理论分子量为30.2177 kD，等电点为8.76。该蛋白与GenBank中已登录的DHAR序列比对显示与黄瓜同源性最高 (87%)。应用实时荧光定量PCR对SgDHAR在罗汉果不同组织及不同倍性中的表达模式分析发现，该基因主要在果实和茎中表达，其次是花，根中的表达量最低；在三倍体中的表达量为二倍体的6.83倍，推测该基因可能参与了三倍体无籽罗汉果的败育过程。这些发现从不同角度去解析三倍体罗汉果种子败育的基因调控网络，将能促进罗汉果育种技术的革新。