miR-30d对肾间质纤维化进程中慢性炎症微环境的调控作用及机制研究

Renal interstitial fibrosis (RIF) is closely related to the induction and maintenance of chronic inflammatory microenvironments, which interact with the malignant tumor through inflammatory mediators and immune signals to form a vicious cycle. miR-30ds are miRNAs that act as oncogenes and accelerate the induction and development of cancer. So far, little is known about the relationship between miR-30d and RIF. The findings from our preliminary experiment indicate that in renal tubular epithelial cells suffering renal interstitial fibrosis there is a persistent over-expression of miR-30d although the mechanism is yet to be explored. Therefore, we propose the hypothesis that where fibrosis exists, miR-30d will induce renal interstitial fibrosis by affecting the renal tubular epithelial cells and the immune cells in the microenvironment. To test the hypothesis and disclose how miR-30d regulates interstitial fibrosis by working on the renal tubular epithelial cells and the immune cells, we explored the significant role miR-30d played in the fibrosis of the renal interstitium from the molecular, cellular and "whole-animal" perspective, using a cell model with an under-expression of miR-30d and an over-expression of HK-2, a rat UUO model with an under-expression of miR-30d and employing real time PCR technology, Western blot analysis, adenovirus vector transfection and RNA interference. This study aims to lay the foundation for revealing the pathogenic mechanism of renal interstitial fibrosis from this new light and to provide a new approach to the prevention and treatment of the disease.

肾间质纤维化（RIF）与恶性肿瘤相似都与慢性炎症微环境的形成与维持密切相关。miR-30d是癌基因的miRNA，促进肿瘤发生和发展，迄今对miR-30d与RIF的关系知之甚少。我们预实验提示RIF中的小管上皮细胞中高表达miR-30d，但其作用机制仍有待探讨。我们提出假说：在纤维化状态下，miR-30d通过作用小管上皮细胞、微环境内的免疫细胞从而诱生RIF。为了验证这一假说，我们制备miR-30d缺陷和高表达的HK-2细胞、miR-30d缺陷的UUO大鼠模型，采用real time PCR、Western blot、慢病毒载体转染、RNA干扰等手段，从分子、细胞、动物整体水平来探讨miR-30d在RIF进程中的重要作用，明确miR-30d通过诱导小管上皮细胞、"驯化"免疫细胞来调控RIF的机制。本研究将从miR-30d这个新视点为揭示RIF的机制奠定基础，为RIF的防治提供新的思路。

急性肾损伤已成为CKD及ESRD发病率增高的最重要原因之一，其预后取决于肾间质纤维化的程度和范围，细胞外基质的大量堆积导致的进行性肾间质纤维化是急性肾损伤慢性转归的共同特征。因此积极探讨TIF的发生机制、开展AKI慢性转归的机制研究对于降低CKD和/或ESRD的发病率将具有重要的临床意义。本课题立足于microRNAs在肾小管上皮细胞和免疫相关细胞内的调控效应，在此基础上研究miRs在炎症微环境中诱发肾间质纤维化的形成进程中的调控作用和信号传导机制。本课题利用了基因芯片扫描、生物信息学、分子生物学等手段在体外模拟炎性微环境中共孵育的细胞、I/R诱导的AKI小鼠、基因敲除小鼠及临床患者等多层次的研究模型中开展工作，为AKI慢性转归的发生、发展的机制阐述提供新的视角，并为发现新的干预靶点提供可能。.（1）我们制备了I/R 诱导的AKI 小鼠动物模型，在I/R后第3H、24H、72H、7D 后处死小鼠，观察各组小鼠肾脏组织的纤维化病理改变，并检测了上述时间点的各组小鼠肾功能改变。实验结果显示AKI诱导慢行转归的小鼠造模成功。.（2）第三代Agilent Scanner G2505C（miRNAs 芯片）扫描LCM系统捕获得到的肾小管上皮细胞的总RNA，进行了差异表达谱的筛选，并对差异表达的miRNAs进行了验证。差异筛选的热图结果提示：9 种筛选到的miRNAs是差异显著的，生物学重复性高。我们用qRT-PCR验证了上述9 种差异表达的miRNAs发现，miRNA-204是一种理想的候选目标基因。我们用TargetScan, PITA, microRNAorg三个数据库对miRNA-204进行靶基因预测，取三个数据库的交集，然后对共同的交集基因进行后续的GO分析和KEGG分析发现：miRNA-204的靶基因绝大多数与间质纤维化中的ECM 的生成和堆积相关；并且miR-204与其靶基因SP1有直接的联系。. 本课题以miR-204为研究对象，聚焦其对CD4+T细胞的调控作用，并以此为基础，探询miR-204对炎症微环境的调控作用和信号传导机制。本课题利用基因芯片扫描、生物信息学、分子生物学等手段在多层次的研究模型中开展工作，为AKI慢性转归的发生、发展的机制阐述提供新的视角，并为发现新的干预靶点提供可能。