猪胚胎玻璃化冷冻保存对其细胞凋亡模式和基因表达的影响

The efficiency of porcine embryo cryopreservation is still very low. Embryo apoptosis and abnormal gene expression after thawing are considered as one of the most important facts for their poor development ability. However, there are no systematic and exact researches on the apoptosis pathways and gene expression in porcine vitrified-thawed embryos. For elucidating the possible apoptosis pathways of vitrified-thawed embryos and providing theoretical and practical references for the usage of apoptosis inhibitors in porcine embryo vitrification, this project will systematically analyse the changes of apoptosis situation, mitochondrial injury and related gene expression with additional uses of Z-IETD-FMK (Caspase-8 apoptosis inhibitor in the death receptor mediated apoptosis pathway), Bongkrekic acid (specific inhibitor of mitochondrial permeability transition pore in the mitochondria mediated apoptosis pathway) and Z-DEVD-FMK (Caspase-3 apoptosis inhibitor in both of the apoptosis pathways) in the procedure of cryopreservation,separately. Meanwhile, this project will detect the gene expression levels of the vitrified-thawed embryos by nanofluidic qPCR system and porcine whole genome microarray analysis technology, which will lay theoretical basis for further increasing the cryopreservation efficiency in porcine embryos.

猪胚胎冷冻保存效率目前仍很低，近年来研究认为冷冻后胚胎细胞凋亡和基因表达异常是其发育能力低下的一个重要因素。目前缺乏系统全面的针对冷冻胚胎细胞凋亡模式和基因表达的研究。本项目拟对猪胚胎冷冻后的细胞凋亡、线粒体损伤和相关基因表达变化进行系统研究，结合利用Caspase-8的抑制剂Z-IETD-FMK（死亡受体介导的凋亡途径）、线粒体通透性转变孔道抑制剂Bongkrekic acid（线粒体介导的凋亡途径）和两者共同作用途径中的Caspase-3抑制剂Z-DEVD-FMK分别在猪胚胎冷冻中进行添加，阐明猪玻璃化冷冻胚胎的细胞凋亡模式，并为凋亡抑制剂在冷冻中的应用奠定理论和现实依据。同时项目还将采用nanofluidic qPCR单细胞多基因表达分析技术和全基因组表达谱芯片分析技术，对冻后不同发育命运胚胎相关功能基因的mRNA转录水平进行检测，为进一步提高猪胚胎冷冻效率提供理论指导。

【背景】猪卵母细胞和胚胎冷冻保存效率目前仍很低，冷冻损伤机理的研究相对缺乏。冻后卵母细胞和胚胎细胞的凋亡和基因表达异常被认为是其发育能力低下的一个重要因素，然而缺乏针对冷冻后细胞凋亡途径和基因表达谱的相关研究。【研究内容】本项目利用Caspase-8的抑制剂Z-IETD-FMK（死亡受体介导的凋亡途径）、Caspase-9的抑制剂Z-LEHD-FMK（线粒体介导的凋亡途径）、总Caspase抑制剂Z-VAD-FMK和抗氧化剂白藜芦醇，针对猪卵母细胞和胚胎冷冻后的氧化应激、线粒体损伤和不同凋亡途径中关键蛋白和基因的表达进行分析，阐明猪玻璃化冷冻卵母细胞和胚胎的细胞凋亡模式，并为凋亡抑制剂和抗氧化剂的应用提供依据。同时项目还利用全基因组表达谱芯片对冷冻前后卵母细胞的全基因组转录水平进行检测，为进一步提高猪胚胎冷冻效率提供理论指导。【重要结果与关键数据】结果显示：1）冻后猪卵母细胞和胚胎多种凋亡途径中的caspase活性和关键蛋白的基因表达水平均发生显著变化，提示死亡受体介导的外源性凋亡和线粒体介导的内源性凋亡共同介导了其冻后凋亡的发生。利用特异性凋亡抑制剂Z-IETD-FMK、Z-LEHD-FMK和Z-VAD-FMK在冷冻猪卵母细胞和胚胎中进行应用，改善了相关基因的表达，降低了细胞凋亡，提高了冷冻效率，从侧面验证了冻后卵母细胞和胚胎细胞凋亡发生的途径。2）冷冻后猪卵母细胞和胚胎线粒体功能发生系统性损伤，包括线粒体分布异常、超微结构损伤、膜电位下降、ROS水平上升、ATP含量下降和相关功能基因异常等。在猪卵母细胞和孤雌激活囊胚中添加RES，可通过改善其冻后线粒体功能，降低细胞凋亡水平和基因表达，从而提高其抗冻能力。3）表达谱分析表明，冷冻能造成猪MII期卵母细胞多系统的损伤，如线粒体损伤、凋亡、坏死、质膜损伤和RNA拼接与代谢等异常。【科学意义】本项目研究一方面发掘了一批与冷冻损伤相关的调控通路，另一方面阐明了猪卵母细胞和胚胎的冻后细胞凋亡途径，为抗氧化剂和凋亡抑制剂在冷冻中的应用奠定了理论和实际依据。