高比表面钛基纳米材料在蛋白质组学样品预处理中的应用研究

High-surface area functional nanomaterials are considered as promising candidates for sample pretreatment in proteomics. In this proposal, we plan to synthesize two types of high-surface area titania-based nanomaterials, titania dioxide nanotube arrays and HTiNbO5 layered materials, which are applied to sample pretreatment in proteomic analysis. Titania dioxide nanotube arrays will be prepared on an ordinary glass slide, and integrated into a microdevice with PDMS as cover slice. Through gravity driven injection, phosphopeptides are on-chip enriched without any equipment from digests of standard proteins, human serum and tissue samples, offering great promise for realizing real-time analysis for minute sample in proteome research. Besides, H2Ti4O9, HNb3O8 and HTiNbO5 layered materials are employed here for co-intercalation of protease and substrate by adjusting pH value. Due to high concentration of protease and substrate among layers, high-efficiency proteolysis is anticipated to be achieved. Meanwhile, taking advantage of the phosphate affinity of HTiNbO5 nanosheets, phosphopeptides from the digests of phosphoproteins are expected to be enriched directly, resulting in the combination between interlaminar digestion of phosphoproteins and interlaminar enrichment of phosphopeptides. In this mechanism, HTiNbO5 layered materials offer a viable route for simplifying sample pretreatment by integrating protein digestion and peptide enrichment in one step.

高比表面功能化纳米材料在蛋白质组学样品预处理方法的开发中具有极大的应用潜力。本项目拟合成二氧化钛纳米管阵列和钛铌酸层状材料两类高比表面钛基纳米材料，并将其应用于蛋白质组学中的样品预处理。以普通载玻片为基底制备不同形貌的二氧化钛纳米管阵列，并引入微器件理念，将二氧化钛纳米管阵列集成于微芯片内。通过重力驱动进样，对蛋白酶解液、血清以及组织样品中的磷酸肽的进行芯片内富集，以实现样品预处理过程中的微量进样和即时分析。此外，充分利用高比表面钛基纳米材料所提供的微环境，通过pH值调节，将酶分子和蛋白底物插入钛酸、铌酸以及钛铌酸层状材料的层间。利用层间空隙和层板对磷酸肽的亲和能力，实现磷酸化蛋白层间酶解和磷酸化肽段层间富集，开发集蛋白酶解和多肽富集为一体的样品预处理材料。

蛋白质组学研究在推动基础生命科学和重大疾病攻克方面都具有重要的意义。样品预处理步骤作为基于质谱的蛋白质组学中的重要环节，直接关系到生物质谱的数据采集质量，是蛋白质、多肽分子质谱检测和鉴定分析的前提。本项目着眼于蛋白质组学样品预处理中遇到的关键科学问题，构筑了以TiO2纳米管阵列和钛铌酸二维复合材料为代表的高比表面钛基纳米材料，并将其引入生物分离研究领域，借助其与磷酸基团的亲和作用实现了磷酸化多肽的分离富集和定性定量分析，取得了一系列创新性研究成果，为磷酸化蛋白质组学研究提供了可靠的样品预处理技术手段。具体研究中，我们构建了TiO2纳米管阵列集成微器件，利用微管道中的TiO2纳米管作为分离介质，在重力驱动下实现了血清中磷酸肽的芯片内富集和同位素标记，该器件有望成为医用耗材模型用于临床体液样品的采集和预处理。此外，以钛铌酸作为亲和材料，构建了一种Fe3O4 嵌入钛铌酸二维复合探针（Fe3O4-TiNbNS），Fe3O4对钛铌酸片层重聚的阻碍作用预留了充足的磷酸肽亲和位点，实现了磷酸肽的高效富集和原位同位素标记，发现了急性早幼粒白血病病人血清中内源性磷酸肽的异常表达情况。同样以钛铌酸纳米片层为基底，我们设计了一种组分可调的Fe3O4/CeO2 共修饰钛铌酸纳米片层二维复合材料，并应用于磷酸肽的分离富集和可控去磷酸，通过CeO2覆盖度的调节同时获取了磷酸肽质谱峰及其去磷酸化产物信号，在一级质谱图中实现了对肽段的磷酸化位点个数的精确读取，该复合材料集成了磷酸肽富集、鉴定、位点计数三重功能。我们开发了以氮掺杂石墨烯为基质的激光解吸负离子电离模式质谱检测方法，由于氮掺杂石墨烯的碳骨架具有优良的能量吸收和传导性能，掺杂吡啶氮作为路易斯碱倾向于捕获待测物中的氢离子从而加速其负离子的产生，该材料在氨基酸、脂肪酸、多肽、类固醇以及抗癌药物检测中展现出了比传统碳基材料更好的激光解吸离子化性能。本项目借助纳米材料成功解决了蛋白质组学样品预处理中的关键科学问题，在实现磷酸化多肽高效分离和精准测量的同时，也为功能纳米材料在生物分离分析中的应用提供了新的途径。