人源脂肪干细胞体外分化的运动神经元样细胞治疗小鼠脊髓损伤的机理研究

Human Adipose-Derived Stem Cells (hADSCs) possess multi-lineage differentiation potentials. hADSCs may differentiate into motor neuron cells as a cell replacement treatment for Spinal Cord Injury (SCI) disease. However, the motor neuron differentiation mechanism including the regulation signaling pathways remains elusive. Our previous data demonstrates that motor neuron like cells differentiated from hADSCs (hADSC-MN) express marker proteins of motor neurons (MN) and acquire electrophysiological property. hADSC-MN can successfully rescue the hindlimp movement function of SCI mice. Our data implied that the differentiation process activated Hedgehog pathway and hADSC-MN was directly involved in re-building of neuron signaling pathway. Based on our results, this study will set up high efficient motor neuron differentiation protocols from hADSCs. Cyto-immunostaining, qRT-PCR and whole cell patch clamp electrophysiology will be used to identify the motor neuron cells. BMS and RotaRod will be used to evaluate the movement function of spinal cord injury mice. Histo-immunostaining, neuron tracing (BDA & WGA) , cell suicide system and animal muscle potential electrophysiology will be used to clarify their repair mechanism for SCI. In all, we expect to find out high specific and efficient differentiation protocols for mature motor neuron production, and demonstrate the repair mechanism of hADSC-MN, which would provide new ideas for the clinical cell replacement-based cell therapy.

人源脂肪干细胞(hADSCs)具多向分化潜能，其向运动神经元(MN)分化可替代治疗脊髓损伤(SCI)，但目前调控hADSCs向MN分化信号通路尚不清楚。前期研究证明hADSCs分化的运动神经元样细胞(hADSC-MN) 表达MN标志蛋白，具电生理活性；数据提示hADSC-MN分化激活了Hedgehog通路，且hADSC-MN直接参与了SCI神经回路重建。据此，本研究拟首先建立高效的hADSC-MN分化方案，用免疫染色、qRT-PCR、膜片钳鉴定hADSC-MN。然后用BMS和RotaRod评估hADSC-MN对小鼠SCI治疗效果，用免疫染色、神经示踪(BDA&WGA)、细胞自杀系统及动物肌电位等研究其修复SCI的机制。目标是找到特异强得率高的分化方案，阐明hADSCs重建神经回路机制，为临床治疗SCI提供新的思路。

随着对干细胞的研究程度日渐加深，人脂肪源性干细胞(hADSCs)被认为是一种在各种退行性和/或创伤性疾病中进行细胞替代治疗的优秀干细胞来源。因此将hADSCs转化为运动神经元细胞的潜力为脊髓损伤（SCI）的治疗提供了另一种新思路。本研究以维甲酸(RA)、hedgehog基因(SHH)和神经营养因子为基础，逐步建立高效的hADSC转分化方案。该方法可将hADSCs转化为具有电生理活性的运动神经元样细胞(hADSC-MNs)，同时表达一组泛神经元标志物和运动神经元特异性标志物。此外，利用RA/SHH启动神经元分化后，将hADSCs移植到SCI小鼠模型中，外源细胞将会在实验动物体内存活、迁移并整合到损伤部位，使SCI小鼠部分功能恢复。使用抗病毒更昔洛韦(antivirial Ganciclovir, GCV)对移植的过表达HSV-TK-mCherry系统的hADSC-MNs进行消融处理时，通过运动诱发电位(MEP)和BMS检测功能复发，这表示移植的hADSC-MNs参与了神经回路的重建，逆行神经元追踪系统(WGA)进一步证实了这一点。将GFP标记的hADSC-MNs在脊髓切片制备中进行全细胞膜片钳记录，记录其动作电位和突触活性，进一步证实这些预处理的hadsc在体内确实成为功能活跃的神经元。此外，移植的hADSC-MNs在很大程度上阻止了损伤性空腔的形成，并具有明显的免疫抑制作用，表现为阻止星形细胞的活化，促进一系列抗炎细胞因子和趋化因子的分泌。我们的工作表明，在体外，hADSCs可以很容易转化为MNs，并在SCI小鼠脊髓中存活，通过免疫抑制重建受损的神经回路，优化微环境，发挥多种治疗作用。